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2024 Topics

glycoRNA

biotechnology

cell biology

세포막 표면 RNA가 호중구(neutrophil)의 이동을 돕는다

세포의 세계는 아직 우리에겐 생소한 것이 많은 것 같습니다. 세포가 보여주는 기발하고 절묘한, 상식을 깨는 자유로운 적응 형태를 보면서 감탄할 때가 많죠. 지질 이중 층으로 구성된 세포막은 가운데 소수성부위가 존재하고 여기에 끼어들어가 있는 막단백질이나 지질 분자에 탄수화물가지가 붙어 각각 당단백질(glycoprotein)과 당지질(glycolipid)을 형성합니다. 이들은 세포 간 결합에 작용하며 면역세포가 염증반응 지역으로 이동하는 데에도 중요한 역할을 하죠. 즉, 염증 발생지역의 혈관 내벽세포(endothelial cell)가 p-selectin이라는 당결합 단백질(lectin)의 일종을 막표면에 발현하게 되면, 혈액속의 면역세포가 여기에 붙어 인근 조직으로 침투하게 됩니다. 이때 selectin이 면역세포의 막 표면에 있는 당사슬에 결합하여 붙잡아주고 침투할 수 있도록 도와주는 것이죠. 그런데 아래 소개한 논문에서는 당RNA(glycoRNA)이 면역세포의 이동에 관여한다는 것을 입증하였습니다. glycoRNA가 어떻게 세포막 표면에 존재하는지는 2020년도에 처음 보고되기 시작했고 이들의 기능에 대해 사람들이 궁금해 하고 있었는데 나온 논문입니다. 아직 모든 기능이 밝혀진 것은 아니지만 염기서열과 관계된 기능을 기대했던 사람들에겐 다소 의외의 결과인 것 같습니다. 하지만 이제 glycoRNA의 존재는 확실해 졌고 이를 만드는데 관여하는 유전자들도 확인되면서 본격적인 연구가 기대되는 상황입니다. (그림 출처: Flynn et al., 2021)

Small Title

새 연구에 따르면 세포막에 결합된 RNA분자가 호중구(neutropil)의 이동에 관여함을 확인하였다.

RNA는 세포 안에 머무는 일종의 집돌이 정도로 알려져 있다. 그래서 몇몇 종류의 세포에서 세포막 표면에 RNA분자가 발견되었을 때, 연구자들은 “무슨 목적이 있는 걸까?” 하고 의문을 가졌다. 최근의 연구가 그 목적 중 하나를 밝힌 것이다: 면역세포를 염증반응 지역으로 이동시키는 것이다.

지난달 Cell지에 발표된 논문에서, Yale University의 유전학자인 Jun Lu가 이끄는 연구팀의 약물학자인 Dianqing Wu는 어떻게 세포막 표면의 RNA가 호중구(neutrophil)를 혈관 내벽세포에 붙여 조직으로 빠져나가게 하는지 설명하였다(1). 이 분자를 제거하면 면역세포가 염증반응 지역으로 빠져나가는데 실패하였고, 이는 잠재적 위협에 대해 면역시스템이 어떻게 반응하는지를 보여준 것이다.

이 연구에 직접 관여하지 않았지만 glycoRNA의 존재를 밝혔던(3) Stanford University의 생화학자인 Carolyn Bertozzi에 따르면, 오랫동안 미스터리로 남았던 세포막 RNA가 지속적으로 관심을 갖고 연구하던 이들에게 마침내 보상을 주었다고 한다. “저는 이들이 (세포막 RNA를) 호중구의 작용을 매개하는 물질로 생각했다는 게 정말 흥미로웠습니다.”

세포막 표면의 RNA는 사람의 면역세포에서 처음 탐지된 2020년에야 알려지기 시작했다(2). 그 다음해에 Bertozzi의 연구팀은 암세포와 줄기세포에서 당사슬에 결합된 형태로 표면에 산재한 RNA를 발견하였다. 당단백질(glycoprotein), 당지질(glycoliid)과 마찬가지로 당RNA(glycoRNA)라고 이름 붙여진 이 새로운 분자는 면역 수용체에 붙어있어서 면역반응에서의 역할이 예상되었다.

Lu가 처음 이 논문을 접했을 때, 그의 반응은 비판적이었다. 즉, 그는 노출된 RNA분자는 어찌 되었든 혈액내 존재하는 RNA 분해 효소(RNase)에 의해 분해될 것이라고 생각한 것이다.

“이게 과연 가능 할까? 라고 고민했죠. 당시 처음 온 박사 후 연구원에게 2달 동안 이게 사실이 아님을 밝히고 그 뒤에 다른 주제로 넘어가라고 얘기할 정도였어요.”

그의 연구팀은 biotin로 표지된 당사슬에 결합하는 분자를 이용하여 호중구의 막 표면에 있는 모든 glycoprotein과 glycolipid, 그리고 아마도 glycoRNA까지 모두 표지를 달았다. 이렇게 표지된 세포에 세포막을 파괴하지 않고 일반 체내 농도보다 훨씬 고농도의 RNase를 처리한 후, 이 세포부터 RNA를 분리하였다. 만약 이 효소처리에 의해 RNA에 따라 나오는 biotin표식이 줄어들었다면, 세포 표면의 당사슬에 RNA분자가 붙어 있다는 증거가 될 것이다. 놀랍게도 표식은 없어 졌고 이는 glycoRNA가 세포 표면에 노출되어 있다는 것을 의미한다.

만약 glycoRNA가 glycoprotein이나 glycolipid와 비슷한 역할을 한다면, 아마도 면역세포의가 염증반응부위로 이동하는 것을 도울 것이다. 이를 입증하기 위해 호중구를 붉게 염색한 후 RNase를 이용하여 그들 막표면의 glycoRNA를 제거하였다. 또 다른 그룹은 녹색으로 염색한 후 표면 RNA를 제거하지 않았다. 이렇게 염색된 두 가지 호중구를 복부 염증이 있는 생쥐에 주사하였다. 그 결과 glycoRNA가 없는 세포들은 염증 부위에 도착할 확률이 떨어지는 것을 알 수 있었다.

조직에 침투하기 위해서는 우선 바깥쪽 세포에 결합하고, 이 후 몇 겹의 세포층을 통과해야 한다. Lu는 glycoRNA가 이 두 단계에 모두 관여하는지 궁금했고, 이를 위해 호중구를 배양중인 내피세포층의 한쪽에 위치시키고 반대편에 이들의 주화성물질을 넣어 보았다. GlycoRNA가 없는 호중구는 잘 결합하지 못했고 세포층을 통한 이동도 감소하였다. 이들은 내피세포층의 장벽이 없을 때는 정상적으로 이동하는 것으로 미루어 glycoRNA가 세포의 이동성에는 영향을 주지 않는 것을 알 수 있었다.

어떻게 glycoRNA가 내벽세포에 결합하는 것을 돕는지 알아보기 위해, 연구자들은 이 분자의 당과 RNA부분을 나누어 비교해보았다. 즉, 같은 세포배양 시스템에서 glycan을 과량 처리할 경우 면역세포의 내벽세포층을 통한 이동이 억제되었다. 반면 RNA를 과량 처리했을 때는 효과가 없었다. 이 발견은 - 다른 당결합 분자들과 마찬가지로 – glycoRNA의 당사슬 부위가 단단한 결합에 관여하고 RNA는 당사슬을 막표면에 가깝게 접근시키는 효과만을 갖는 다는 것을 나타낸다.

이 경우 RNA가 단순 구조물로서의 역할을 한다면 RNA의 염기서열은 중요치 않을 것이라고 설명한다. “염기서열의 기능에 대한 숨은 비밀이 있을 수 있겠죠.” Lu는 말한다. “이건 빙산의 일각에 불과 합니다.”

연구자들은 glycoRNA의 RNA가 내부에서 왔는지 또는 다른 죽은 세포에서 방출된 외부RNA에서 왔는지 알아보고자 하였다. 이를 위해 또 붉은 색과 초록색 2 가지 염색을 통해 호중구를 각각 염색하였고, 초록색으로 염색된 호중구에서만 glycoRNA를 화학적으로 표지하였다. 이 세포들을 섞어서 사흘 동안 배양하였고, 연구진은 오직 초록 세포에서만 표식을 발견할 수 있었다. 이는 RNA가 외부에서 들여온 것이 아니라 집안에서 만들어졌다는 것을 말한다.

GlycoRNA의 RNA를 분석해보면 라이보솜 RNA, transfer RNA, small nuclear RNA 등임을 알 수 있고 이는 비암호화 RNA의 재활용일 가능성을 제시한다. 이들 RNA들이 세포막으로 가는 규칙이나 어떻게 완전히 분해되지 않고 남아 있는지 등은 아직 분명치 않다.

Yale의 연구진들에겐 앞으로 계속 추궁해야 할 질문들이 있다. 각종 질병과 관련하여 glycoRNA에 변화가 있는지 연구할 계획이다. 하지만 이들을 실시간으로 분석할 기술이 없기에 어려움이 있을 것으로 예상된다. “여러 질문을 던지기 이전에 방법론적인 개선이 필요합니다.” Wu의 말이다.


<이글은 아래의 기사를 번역한 것입니다.>

Holly Barker, PhD, 2024, Cell surface RNA helps neutropils get around. The Scientist Apr 2, 2024.

<원 기사의references>

1. Zhang N, et al. Cell surface RNAs control neutrophil recruitment. Cell. 2024;187:846-860.

2. Huang N, et al. Natural display of nuclear-encoded RNA on the cell surface and its impact on cell interactions. Genome Biol. 2020;21,225.

3. Flynn RA, et al. Small RNAs are modified with N-glycans and displayed on the surface of living cells. Cell. 2021;184, 3109-3123.e22.

memory

neuroscience

cell biology

기억은 DNA가 잘리고 회복되면서 만들어진다.

뇌에 관한 연구는 분자생물학적인 기술과 생체를 분석하는 각종 기술들이 발달하면서 놀라운 발견들이 이어지고 있습니다. 특히 동물을 이용한 실험을 통해 후성유전학적 변화와 RNA 그리고 유전체의 변화가 뇌의 기능에 영향을 미친다는 사실이 알려지면서 과연 어떤 진실이 숨어 있을까? 하는 기대감이 듭니다. 이와 동시에 이런 동물실험들이 인간에게 얼마나 적용될 수 있을까? 하는 회의적인 생각도 듭니다. 이번에 소개할 논문은 기억형성과정에서 신경세포의 DNA가 끊어지고 다시 회복되는 염증반응이 필요하다는 사실을 밝힌 논문입니다. 단, 여기서 얘기하는 기억(memory)은 사람이 무언가를 공부해서 머리에 집어넣는 서술적 기억(declarative memory)을 얘기하는 것은 아닙니다. 여기서의 기억은 전기쇼크를 받았던 것을 기억하는 일종의 정신적 외상(트라우마, trauma)을 말합니다. 사실 개인적으로 이 정신적 외상이라는 말을 처음 들었을 때 “혹독한 정신적 경험이 실제로 물리적인 손상을 입힐 수 있을까?” 라고 생각한 적이 있습니다. 그런데 이 논문에 따르면 트라우마를 겪는 과정에서 실제로 신경세포의 DNA가 끊어지는 손상을 입을 뿐 아니라 이를 회복하는 과정이 상처처럼 뇌에 남게 된다는 것이죠. 인간은 살면서 여러 사건으로 인해 트라우마를 겪기 마련입니다. 이런 트라우마는 종종 가족이나 당사자에게 큰 문제가 될 수 있죠. 이 논문은 이런 문제를 해결하는데 중요한 단서가 될 것이라고 생각합니다. 유명 학술지에 실린 만큼 실험기술이나 결과의 해석에 대해서는 충분히 검증이 됬겠지만, 사실 많은 실험이 사후에나 가능한 것이라는 점도 고려되어야 할 것 같군요.

Small Title

생쥐의 신경세포는 염증반응의 도움을 받아 장기기억을 만든다.

장기기억(Long-term memory)이 만들어질 때 신경세포는 자신의 DNA가 끊어질 정도의 강력한 전기적 활성을 경험하게 된다. 이어서 염증반응이 일어나 이렇게 만들어진 손상을 회복하고 기억을 견고하게 만들어준다는 사실이 생쥐 실험을 통해 밝혀졌다.

지난 3월 27일 Nature에 발표된 논문의 내용은 “정말 흥미롭습니다.” 이 연구에 직접 관여하지 않은 MIT in Cambridge 의 신경생물학자인 Li-Huei Tsai의 말이다. 그들에 따르면 기억을 형성한다는 것은 “위험한 일”이라는 것을 보여준 겁니다.  그녀는 말을 이었다. 일반적으로 DNA 이중 나선의 두 가닥이 모두 끊어지는 것은 암을 포함한 질병 들과 관련되어 있다. 하지만 이 경우는 DNA가 끊어지고 회복되는 주기가 어떻게 기억이 생성되고 유지되는 지를 설명해준다.

이 논문은 또한 흥미로운 가설을 제시한다: 즉, Albert Einstein College of Medicine in New York City의 신경 과학자이며 이 논문의 공동저자 이기도 한 Jelena Radulovic은, 알츠하이머와 같은 퇴행성 신경질환 환자 들은 이 과정에 문제가 있어 신경의 DNA에 이상이 누적된 것이 아닐까? 라는 가설을 제시하였다.


염증반응

이 논문이 DNA 손상이 기억과 관계가 있다는 것을 처음 주장한 것은 아니다. 2021년 Tsai와 동료들은 DNA 이중가닥 손상이 뇌 전체에 걸쳐 일어나며 기억과 관련되어 있음을 보여 주었다.

DNA 손상이 기억형성에 어떻게 관여하는지를 보다 자세히 알아보기 위해, Radulovic과 동료들은 생쥐를 조그만 우리에 넣어 전기 쇼크를 주는 방법으로 훈련시켰고, 이렇게 훈련된 생쥐는 다시 그 케이지에 들어가면 그때의 경험을 기억하여 몸이 굳어버리는 “얼음”(“freezing”)반응을 보인다. 이때 연구자들은 기억에 중요한 역할을 하는 부위(해마 부위, hippocampus)에 신경세포들의 유전자 발현 양상을 조사하는 것이다. 이들은 훈련 후 4일이 경과했을 때 일부 염증관련 유전자들이 활성화되어 있음을 발견하였고, 3 주 후에는 이들 유전자들의 발현이 훨씬 덜 발현되는 것을 알았다.

이 연구진은 이 염증 반응의 원인 단백질을 특정했는데: 세포내 DNA 조각에 반응하는 Toll-like receptor 9(TLR9)이였다. 이 염증반응은 외부 침입자의 DNA 조각에 반응하는 것과 비슷한데, 이 경우는 신경세포 자신의 DNA 조각에 반응하는 것임을 알아냈다.

TLR9은 DNA손상에 회복반응을 하는 해마의 특정 부위 신경세포들에서 가장 활성화되어 있었다. 이 세포들은 DNA 회복 기구가 세포분열과 분화에 관여하는 세포내 소기관, 중심체(centromere)에 모여 있다. Radulovic에 따르면 대부분의 신경세포는 분열을 하지 않으니 이들이 DNA 회복에 참여한다는 건 놀라웠다고 한다. 그녀는 기억이 외부 침입자를 제거하는 기전과 비슷한 방법으로 형성되는 지 궁금했다.  달리 말하면, DNA 손상에 이은 손상-회복 주기 동안 신경세포가 기억-형성에 관한 정보를 만드는지 알고 싶었다. 

연구자들이 이 TLR9유전자를 생쥐로부터 제거하면, 훈련에서 얻은 기억을 회상하는데 문제가 생기고 이들은 정상 생쥐에 비해 전기 쇼크를 받았던 상자에 들어갔을 때 훨씬 낮은 빈도로 “얼음”반응을 보인다. Radulovic에 따르면 이 발견은 “우리가 자신의 DNA를 오랫동안 정보를 유지하기 위한 일종의 신호 물질로 사용한다.”는 것을 말한다.


연구 결과의 해석

이들의 발견이 그 동안 기억에 관해 알려진 사실들과 어떻게 맞아 들어갈지는 아직 확실치 않다. 예를 들어, 연구자들은 engram(기억의 잔상)이라고 부르는 해마 속 일군의 신경세포들(잔상세포)을 발견했다. 이 세포들은 각 기억에 대한 물리적 흔적이라고 할 수 있고, 학습이 이루어질 때 특이한 유전자들이 발현된다. 그런데 Radulovic과 동료들이 발견한 기억-관련 염증반응은 주로 잔상세포들이 아닌 세포에서 관찰되었다고 한다.

Trinity College Dublin의 회상 신경학자인 Tomás Ryan는 “이 연구는 DNA 손상, 회복이 기억에서 중요하다는 것을 보여준 현재까지의 증거 중 가장 좋은 것”이라고 했다. 그러나 그는 이 신경들이 기억의 잔상을 만들었다는 것에 대해 의문을 갖는다. - 대신, DNA 손상과 회복은 잔상 생성의 결과로 일어난 것일 수 있다는 것이다. “잔상을 만드는 것은 충격이 큰 사건입니다; 이후에 다시 원상 회복을 위해 많은 일을 해야 하는 거죠.” 그의 주장이다.

Tsai도 이어지는 연구에서 어떻게 DNA의 double-strand break가 일어나는지, 다른 뇌 부위에서도 일어나는지 밝혀지기를 바란다고 했다.

Ryan과 함께 Trinity College Dublin에 근무하는 신경과학자인 Clara Ortega de San Luis는 이런 결과들이 기억 형성의 기전과 세포내 환경 유지에 그 동안 요구되었던 깊은 관심을 불러일으켰다고 했다. “우리는 신경세포간의 연결과 가소성 등에 대해 많은 것을 알고 있지만, 정작 신경세포 안 일어나는 일에 대해서는 그만큼 알지 못하는 것 같아요.”라고 말했다.

<이글은 아래의 기사를 번역한 것입니다.>

Max Kozlov, 2024, Memories are made by greaking DNA-and-fixing it. Nature News 27 March 2024.

(doi: https://doi.org/10.1038/d41586-024-00930-y)

<원 기사의 references>

1. Jovasevic, V. et al. Nature 628, 145–153 (2024).

2. Stott, R. T., Kritsky, O. & Tsai, L.-H. PLoS ONE 16 , e0249691 (2021).

3. Josselyn, S. A. & Tonegawa, S. Science 367, eaaw4325 (2020).

biotechnology microbiology

cancer

cell biology

암 면역치료를 돕는 미생물 치료법

제 3 세대 항암치료 기법인 Chimeric Antigen Receptor(CAR) T 세포 면역치료제는 생명공학적인 방법으로 암의 공동 항원에 반응하는 T 세포를 만들어 환자에게 주입하는 치료법입니다. 현재까지 혈액암을 치료하는데 획기적인 성과를 보여 준다고 평가되지만, 암의 종류에 따라 치료성공율이 50 - 85%로 다양하며 재발율도 상당히 높다는 단점이 있지요. 그리고 무엇보다 혈액암을 제외한 다양한 고형암(solid tumor: 간암, 신장암, 췌장암, 전립선암 등 다양한 조직 암이 포함된다)에는 그 효과가 떨어진다는 단점도 있어 개선이 요구되고 있습니다. 아래에 소개한 글은 이런 단점을 줄이기 위한 노력으로 박테리아를 이용한 참신한 방법을 소개하고 있습니다. 모든 첨단연구는 그 결과를 예측하기가 어렵죠. 이론적으론 완벽한데 결과는 실망스러울때가 있고 또 그 반대로 결과에 대한 예측이 대체로 비관적이었지만 뜻하지 않은 좋은 결과를 주는 경우가 있습니다. 대부분의 성공적인 연구는 실험자의 긍정적인 마인드와 그를 뒷받침 할 수 있는 문제 해결능력이 성공의 열쇠인 것 같은데요. 아마 암 치료를 위해 박테리아를 암환자 몸에 투입한다면 왠만한 사람들은 펄쩍 뛸 일이지만, 그 결과는 이글에서 표현하듯이 "아름답다."고 할 수 있을 정도입니다. 어떻게 이런 방법이 작동하는지 설명해보겠습니다.

Small Title

생명공학적으로 만들어진 박테리아(bioengineered bacteria)CAR T cell이 암을 공격할 수 있도록 종양에 침투시킨다.

1890년 의사였던 William Coley는 어떤 암환자가 비슷한 시기에 박테리아에 감염된 뒤 자연 치유되었다는 사실을 알고 암 환자에게 박테리아를 주사하는시술을 했다. 그는 면역 활성화와 항암 작용을 처음 연관 지은 과학자였고 이로 인해 그에게 “면역치료의 아버지”라는 칭호가 주어진다. 임상에서의 몇 차례 성공이 있었으나 안전문제와 방사선치료의 발전으로 Coley’s toxin이라고 불리던 이 박테리아 묘약은 자취를 감추게 된다.

지난 수 십 년간 면역학, 미생물학, 그리고 합성생물학(synthetic biology)의 발전으로 암 치료에 생명공학적으로 변형된 박테리아(bioengineeredbacteria)의 사용에 대한 관심 다시금 커지고 있다. 최근 Science지에 발표된 논문에 따르면 이 bioengineered bacteria는 종양에서 군집을 형성하여, 유전자조작이 된 T 세포를 종양으로 유도하도록 설계되었다. 이 참신한 치료법은 단순히 bioengineered bacteria가 치료가 어려운 고형 종양(solid tumor)에 접근을 용이하게 하여 기존의 면역 치료를 도왔을 뿐 아니라, 살아있는 약재의 다양한 가능성을 보여주었다.

종양의 미세 환경은 쉽지 않은 생태계라고 할 수 있다. 하지만 “박테리아들은 이런 것에 신경 쓰지 않고 오직 신체의 면역시스템을 피해 살아갈 수 있는 환경이 절실하죠.” Columbia University의 합성 생물학자인 Tal Danino의 말이다.

고형 종양의 내부는 저산소 지역으로 가장 면역 감시가 적게 이루어지는 곳으로 박테리아에겐 좋은 집이 될 수 있다. 하지만 박테리아들은 아직 건강한 기관에서도 자리를 잡기 때문에 박테리아의 유전자를 조작하여 병 독성 또는 독성을 낮추는 방법을 모색해야 한다. 이렇게 약화된 박테리아는 생쥐나 사람에서 더 안전하다는 것이 입증되었으나 종양내 군집형성 능력이나 종양치료에 효과가 떨어지는 것을 알 수 있었다. 이에 종양 표적화와 선택성을 개선하기 위한 합성생물학적 해결책을 찾게 되었다.

Jeff Hasty와 Omar Din과 함께 Postdoc으로 일하던 Danino는 박테리아가 일정한 밀도 이상으로 자라면 쿼럼(quorum)현상(2023-06-17, 박테리아의 군체밀도 감지 참고)에 의해 동시에 용해(lysis)되도록 만드는 작은 유전자 고리를 개발하고 있었다. 이렇게 용해가 일어나면 세포내 유전자 산물들이 모두 쏟아져 나오게 된다. 몇몇 박테리아가 용해되지 않지만 다음 번 번식기에는 용해가 일어난다. “일종의 불완전한 시스템인데 도리어 이게 이 시스템의 아름다운 점이라고 할 수 있습니다.” Danino 연구팀의 대학원생이며 논문의 공동저자인 Rosa Vincent의 말이다. “이는 주기적인 전달 방법이라고 할 수 있죠.”

Danino는 이 진동성 유전자고리를 이용하여 의생물학적 문제를 해결하는데 흥미를 느껴 박테리아를 이용한 암 치료에 집중하게 된다. 박테리아는 이미종양에 들어가려는 성향이 있기에 그는 박테리아가 진단 또는 치료물질을 만들도록 생명공학적인 조작만 하면 되었다. 이는 마치 트로이 목마와 같은 것이다.

“박테리아를 이용해 특정 부위를 표지 한다는 것은 항원 이질성(antigen heterogeneity)에 따른 문제를 해결하는데 굉장히 좋은 해결책이 될 수 있어요.”Stanford University의 생명공학자인 Rogelio Hernández-López의 말이다. 고형 종양을 chimeric antigen receptor(CAR) T 세포와 같은 항원-표적치료로치료하기 어려운 이유 중 하나가 종양의 표면에 노출된 암 특이적 항원이 아주 적다는 것이다. 더구나 종양-관련 항원은 환자나 암의 종류에 따라 다르며,마치 의사들이 움직이는 과녁을 쏴야 하는 것처럼 돌연변이를 통해 표적치료를 피할 수도 있다.

“만약 적절한 항원이 없다면 우리가 어떻게 좋은 CAR를 만들 수 있겠어요.” CAR T cell의 논리-지향적 접근법에 참여했던 Vincent가 말을 이었다. 이런 문제는 그녀가 Danino의 박테리아에 대한 생명공학적 변형 작업에 참여하도록 만들었다.

트로이 목마를 만들기 위해, 연구자들은 Danino의 쿼럼 감지 용해회로를 갖는 대장균 Nissle 1917 품종(strain)에 생명공학적 변형을 시도했다. 일단 일정수준의 쿼럼에 도달하면 이들은 합성 항원을 분비하기 시작한다. 특수하게 초록형광단백질(green fluorescence protein, GFP)placental growth factor의헤파린 결합영역(Heparin binding domain, HBD)과 결합시킨 것이다. 잘 결합하는 HBD가 종양의 독특한 콜라겐과 다당류에 부착하고 GFP 깃발이 종양에 심어지는 것이다. 비록 이 분자가 건강한 조직에서도 발견되지만 이들은 종양에 훨씬 많다. “이 종양에 선택적인 박테리아에 전적으로 의존하는 겁니다.” Vincent의 말이다.

대부분의 FDA 승인을 받은 CART cell 치료법은 cluster of differentiation19(CD19)이라는 종양 항원을 표적으로 삼는다. 하지만 VincentGFP 항원을 표적으로 하는 CAR을 디자인한 것이다. “우리는 종양을 푸른 색으로 칠하고 T 세포로 하여금 푸른색을 감지하도록 만든 겁니다.” 라고 말했다. “CAR의 아름다운 점은 모듈로 되어 있다는 점입니다. 그래서 항원결합분위를 다른 것으로 완전히 대체할 수 있다는 거죠.” 라고 Vincent는 말했다.

이들이 이 미생물 기반 CAR 시스템(probiotic CAR system)을 실험실에서 인간 암세포에 처리하면, GFP가 없는 시스템에 비해 특이성이나 세포독성이높게 나타난 것을 보았다. 이어진 실험실 연구에서 이들의 시스템은 이제 배양기 밖에서 시행에 옮길 준비가 되었음을 보여준다.

Probiotic CAR 프랫폼을 시험하는 첫 생체 실험으로, 사람의 종양조직을 피부아래 심은 면역결핍 생쥐를 이용했다. Engineered Bacteria를 직접 종양에주사한 후 quorum-related release가 일어나 GFPengineered CAR T cell을 주사하기 전에 발현되도록 48시간을 기다린다. 이렇게 시행된 engineeredprobiotic CAR system은 종양의 발달을 막았고 flow cytometry를 이용한 분석에서 T 세포의 활성이 증가한 것을 알 수 있었다.

연구자들은 부분적인 시스템은 부분적인 반응을 일으킨다는 것을 알아냈다. 즉, 빈(GFP가 없는) 박테리아를 주사해도, engineered CAR이 일부 작동하여일부 T 세포가 종양부위에서 활성화된 것이다. “제가 이 시스템에서 좋아하는 점은 T 세포가 정말 강하게 박테리아에 반응한다는 것입니다.” Vincent의 말이다. “이런 사실이 이들 박테리아 사용을 선호하게 만드는 겁니다. 이들이 탑재물을 내놓을 수도 있지만 이들은 선천적으로 (면역을) 자극할 능력이 있어차갑던 종양을 뜨겁게 만들 수 있죠.”

CAR T 세포의 증식과 지속성을 증가시키기 위해 환자는 혈액내 T 세포를 죽이는 림프구 제거(lymphodepletion)를 거쳐야 한다. 하지만 면역치료의 장기적인 목적은 온전한 면역체계에 적용하는 것이다. “아마도 우리는 전체 종양을 제거하기 위해 어느 한 항원에 대한 면역력 보다는 전체 면역 시스템의 도움이 필요할 것입니다.” 라고 Vincent는 말했다.

이들의 시스템을 온전한 면역 체계 안에서 실험해 보기 위해, Vincent와 그녀의 동료들은 쥐의 뒤쪽 양측면에 생쥐-유래 종양세포를 주사하였고 그중 하나에 engineered bacteria를 주사하였다. 이후 몇일 뒤에 다시 두 차례 CAR T 세포를 처리하였다(이는 T 세포가 소모되는 것을 방지하기 위해 잉여의CAR T 세포를 넣어주는 것이다). 이 연구자들이 바란 것은 이들의 시스템이 다른 반대편의 종양도 인식할 수 있을 정도로 충분한 염증반응을 유발하기를기대한 것이다. 그리고 그 결과로 처리한 종양과 함께 처리하지 않은 종양도 감소하는 것을 발견했을 때 흥분하지 않을 수 없었다.

피하주사 실험은 다음 실험을 준비하게 된다: 정맥주사를 통해 probiotic CAR system을 넣는 것이다. 이를 위해 사람의 암세포를 면역을 약화시킨 생쥐의젖선 지방질에 이식하고 이어 probiotic CAR 치료를 조금 변형하여 주입한 것이다. CAR T세포가 종양에 더 잘 가도록 만들기 위해 engineered bacteria가면역세포를 유도하는(주화성, chemotaxis) 사람 chemokine ligand 16(CXCL16)을 같이 분비하도록 만든 것이다. 이렇게 CAR T 세포가 종양을 향해 이동하도록 농도 기울기를 형성시킨다. 이 주화성 chemokine의 첨가는 종양의 성장을 억제한다는 면에서 일반적인 probiotic CAR system의 효과를 훨씬 능가하도록 시스템을 보강하였다. 이에 더해 다른 기관들을 분석한 결과 박테리아와 GFP의 발현은 종양부위에 국한되어 나타났다.

이런 실험을 사람에게 시도하기 전에 연구자들은 우선적으로 engineered bacteria가 계속 자라지 못하게 유전적으로 종결시켜야 한다. 이 실험에서는 야생형 대장균을 사용했지만 사람의 경우는 생쥐에 비해 gram negative 균의 독성에 더 민감하다. “이제 실험실의 주 관심은 어떻게 적합한 박테리아 품종을만드느냐에 있습니다.” 라고 Vincent가 말했다.

“이는 두 가지 별개의 생명공학적 시스템들이 상호 보완하여 시너지효과를 보여준 예라고 할 수 있습니다.” Hernández-López의 말이다. “(Danino는) 오랜기간 동안 박테리아 용해 회로를 발전 시켜왔고 이것이 다른 접근법과 합해지는 걸 본다는 건 기쁜 일입니다.”

Danino는 박테리아를 보면, 종양에 치료약을 전달하는 다양한 플랫폼과 그 밖에 다른 가능성까지 보게 된다. CAR T 효율을 높이기 위한 종양 미세환경재구성을 넘어서, 이 engineered bacteria가 PET나 MRI, 초음파, 그리고 약물전달을 위한 나노입자에 대해서도 도움을 줄 수 있을 것이라고 본다. “우리는다른 연구자들이 그들이 개발한 특정물질이나 다른 암 관련 물질들을 전달해 줄 수 있는 플랫폼을 만든다는 게 정말 흥미롭습니다.” Danino의 말이다.

“미생물에 대한 생명공학 기술들이 천천히 T 세포 분야의 기술들과 만나는 과정이고, 다음에 어떤 일들이 일어날지 기대되기도 합니다.” 라고 Hernández-López가 말했다.

<이 글은 아래의 기사를 번역한 것입니다.>

Danielle Gerhard, PhD, Bugs as drugs to boost cancer therapy. The Scientist Jan. 18, 2024

<원 논문>

Vincent RL, et al. Probiotic-guided CAR-T cells for solid tumor targeting. Science. 2023;382(6667):211-218.

microbiology superbacteria antibiotics

evolution

cell biology

항생제로부터 박테리아가 살아남는 방법

언제부턴가 항생제는 의사의 처방없이는 복용하지 못하도록 법으로 금지하고 있지요. 항생제가 많은 환경에서는 일반 박테리아보다 항생제-내성 박테리아가 번창할 가능성이 높기 때문입니. 소위 슈퍼박테리아로 불리는 다제내성(multi-drug resistance)박테리아는 반코마이신(vancomycin)을 비롯한 의료계에서 사용중인 거의 모든 항생물질에대해 내성을 갖는 세균으로 일단 감염이 되면 치료가 아주 어렵습니다. 특히 면역력이 떨어진 환자에겐 치명적이죠. 그런데 사실 항생제 치료에도 살아남는 박테리아가 모두 항생제-내성 유전자를 갖는 것은 아닙니다. 이중 일부는 항생제 치료에도 근근히 연명하며 살아갈 수 있고 이들을 퍼시스터(persisters: 굳이 번역하자면 '끈질긴 균들'이라고 할 수 있겠네요)라고 부릅니다. 아래 소개한 글은 우리 몸에 설사 등 식중독을 일으키는 대표적인 박테리아인 Salmonella가 항생제와 대식세포를 만났을 때 어떻게 죽지않고 persister 상태가 되는지 그리고 이 상태에서 무슨 변화를 겪는지 등을 연구한 논문을 소개한 글입니다. 대부분의 항생제는 세균이 성장시 필요한 성분의 합성을 막아서 세균을 죽입니다. 그러니 성장을 하지 않고 휴면상태를 유지하면 항생제의 영향을 덜 받고 생존할 수 있는 것이죠. 이때 대부분의 균들은 이런 상태에서 살아남기 위해 항생제가 없어졌을 때 다시 번성하기 위한 유전자들이 소실되고 재발할 능력을 상실하게 되는데, persister들은 이런 상황에서 DNA 합성과 회복과정이 활성화된다는 것을 발견한 것입니다. 왜 생존에 위협을 주면서까지 이런 활성을 보일까요? 아마도 대부분의 항생제내성 유전자들이 기존의 유전자에 돌연변이가 생겨서 만들어졌다는 점을 생각해보면 그 답을 예측할 수 있을 것입니다. 진화는 도전과 적응이라고 할 수 있죠. 환경이 어려워지면 살아남아 적응할 수 있는 시간을 벌고 이때 적응이 빨리 일어나도록 유전자에 변형이 활성화되는 것은 아닐까요? 다양한 유전자풀을 갖추어 다음에 다시 번창할 수 있도록 준비하는 것이 진화에 도움이 되었을 것이라는 추측을 해봅니다.

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항생제 처리에서 비슷하게 살아 남은 두 종류의 살모넬라균(Salmonella)들은 전혀 다른 분자 기전에 의해 만들어진다.

항생제에 내성이 생긴 박테리아는 약을 처방해도 번창하여 치명적인 그리고 치료 불가능한 병을 일으킨다. 어떤 박테리아는 전-내성 상태로 존재할 수도있다. 살아남기 위해 성장을 늦추고 약에 견디고, 약의 존재에도 살아갈 수 있는 형질로 바뀌는 돌연변이가 생기도록 하는 것이다. 어느 순간 항생제가 없어지면 이렇게 살아남은 박테리아들이 다시 자라기 시작하고 병을 일으킨다.

치료제가 없는 감염성 질환은 심각한 문제이다. 점점 증가하는 건강에 대한 위협과 싸우기 위해 Harvard Medical School의 Peter Hill과 그의 동료들은 어떻게 항생제 내성(tolerance or resistance)과 지속성(또는 생존능력: persistence)이 생기는지를 정리해보았다. 그리고 이들은 죽지 않고 남은 박테리아가특정 DNA repair system(DNA 손상 회복 시스템)을 활성화시키고, 이때 만들어진 영양소 합성관련 유전자의 돌연변이를 통해 항생제 내성이 된다는 사실을 Cell Host & Microbe지에 발표했다.

“항생제 내성은, 어떤 면에서는 문제의 마지막 단계입니다.” 이제는 Imperial College London의 연구원이된 이 연구의 공동저자 Peter Hill의 말이다. “만약이 과정을 처음부터 막을 수 있다면, 이 마지막 단계를 막을 수 있을 겁니다.”


살아남기 위한 죽은 척하기

어느 돌연변이가 내성의 원인인지 알아보기 위해, Hill과 그의 동료들은 설사를 유발하는 Salmonella균을 대식세포에 감염시키고 여기에 항생제를 처리하여 내성을 유도하면서 살아남은 박테리아의 유전체를 분석했다. 이들은 박테리아가 살아가는데 필수적인 분자를 만들지 못하게 하는 돌연변이를 발견하였다. 이 분자를 만들지 못하는 박테리아는 천천히 자라게 되며, 이는 분열하는 세포를 죽이는 항생제로부터 살아남게 해준다. 내성이 있는 박테이아는 영양분이 풍부한 배지에서만 만들어지기 때문에, Hill은 Salmonella균이 좋은 환경에서 격리되면 항생제에 민감해지는 것을 볼 수 있었다.

다음으로 항생제 지속성 (antibiotics persistence: 항생제의 영향을 받지만 죽지는 않고 견디는 것을 말한다)을 연구했다. 이는 항생제에 반응하는 박테리아의 일부가 형질 변화로 일시적인 성장 지연이나 멈춤을 통해 죽지 않고 견디는 것이다. 마치 내성을 가진 벌레가 휴면상태로 있듯이 살아남은 박테리아(persister)들은 macrophage(대식세포) 안에서 자라지 않거나 아주 천천히 자란다. 하지만 항생제가 제거되면 이 대식세포 안의 Salmonella persister 들은 다시 살아난다. 이런 생존력(persistency)은 돌연변이보다는 형질변화를 통해 이루어지기 때문에, Hill과 동료들은 항생제 처리가 이 휴면기 군집의 유전자 발현에 어떤 영향을 주었는지 알아보고자, 이 persister들의 RNA-sequencing을 수행했다. 이들이 발견한 것은 이들이 마치 double-strand breaks in DNA(DSBs: 대식세포 안과 같은 혹독한 환경에서 흔히 발생할 수 있는 일이다)에 반응한 것과 같은 스트레스 경로가 활성화된다는 것이다. “일반적으로 박테리아의 DNA 복제가 일어나면 세포분열이 뒤따르죠.” Hill의 설명이다. “그런데, 우리가 발견한 것은 이 분열을 멈춘 박테리아에서 DNA 복제가 적어도 일부 형태로라도 이루어진다는 겁니다.” 

이에 더해 Hill의 팀은 persister Salmonella균이 약이나 대식세포로부터 살아남기 위해서는 스트레스반응을 활성화시키고 DSB를 고쳐줄 DNA회복 기전이 필요하다는 것을 발견했다. 손상을 복구한 후 persister들은 임상 감염의 재발과 유사하게 다른 숙주세포에서 감염을 다시 시작한다.


실험실에서 임상으로

실험실에서 대식세포를 이용한 실험은 많은 정보를 주지만 Hill과 그의 팀은 실제로 사람의 몸에서 일어나는 일을 알고 싶어했다. 이들은 환자로부터 유사한 종류의 Samonella균을 얻어 유전체를 분석했다. 놀랍게도, 이들에게 선 어떤 항생제 내성 유전자도 발견하지 못했다. 이는 세포배양 실험과는 다른 결과로(실험실에서는 내성 유전자의 돌연변이가 주요 생존 원인이다: https://www.youtube.com/watch?v=yybsSqcB7mE), 그 대신 이들은 항생제를 처리한대식세포에서 persistent 박테리아와 유사한 성장을 보였다: 일부 세균 집단은 항생제에 비교적 강했고, DNA 회복반응이 강력하게 활성화되어 있었다.

임상에서 분리된 균들이 [DNA 회복]과 관련하여 persister 균과 비슷하다는 것은 아주 재미있는 발견입니다.” 이 연구에 직접 관여하지 않은 HebrewUniversity of Jarusalem의 교수인 Nathalie Balaban이 보낸 이메일 내용이다. “이렇게 임상에서 분리된 균들이 대식세포를 더 감염시키는지 보는 것도 좋을 것 같군요.”라고 하였다.

DNA 회복이 persistency와 내성을 갖는데 어떤 기능을 갖는지 이해하는 것이 박테리아의 감염에 대비한 전략을 짜는데 도움이 될 것이다. 항생제 처리와함께 Salmonella의 생존에 필요한 DNA 회복 기전을 억제하는 것이 감염의 재발을 막고, 항생제 내성의 출현을 늦출 수 있을지 기대해 본다.


<이글은 아래의 기사를 번역한 것입니다.>

Niki Spahich, PhD., Bacteria go dormant to survive antibiotics and restart infections. The Scientist Mar 7, 2022

<원 기사 References>

1. P.W.S. Hill, S. Helaine, “Antibiotic persisters and relapsing Salmonella enterica infections,” in Persister Cells and Infectious Disease, K. Lewis, ed.,Springer International Publishing, 2019, pp. 19-38.

2. P.W.S. Hill et al., “The vulnerable versatility of Salmonella antibiotic persisters during infection,” Cell Host Microbe, 29:1757-73.e10, 2021.

3. C.K. Okoro et al., “High-resolution single nucleotide polymorphism analysis distinguishes recrudescence and reinfection in recurrent invasivenontyphoidal Salmonella typhimurium disease,” Clin Infect Dis, 54:955-63, 2012.

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