딱딱한 부위를 풀어주는 돌연변이는 핵으로의 이동속도를 폭발적으로 올려준다.

핵의 경계면에 있는 출입구는 언제나 붐빈다. 유전자 산물은 핵에서 시작하여 mRNA의 형태로 세포질로 이동하고, 거기서 단백질 합성의 주형으로 활동한다. 이들 중 많은 것들, 예를 들면 전사인자들이 다시 핵으로 돌아 들어간다. 핵막을 통과하기 위해서는 핵공복합체(nuclear pore complex, NPC)를 통과해야 한다. 이 단백질 복합체는 핵의 출입문 역할을 하며 핵위치신호(nuclear localization signal, NLS: 이 아미노산 서열을 가진 단백질들은 핵으로 이동한다.)를 가진 단백질 들만을 선택하여 들여보낸다.

최근에 Nature Physics에 발표된 논문에 따르면, 이 NLS 서열 가까이에 유연한 부위를 넣어주면 핵으로 들어가는 속도가 높아진다고 한다. 이 유연한 단백질을 본떠서 생물리학자들은 훨씬 더 빠른 속도로 핵으로 들어가는 단백질을 디자인했다.

“사람들은 어떻게 치료나 진단 분야뿐 아니라 순수 연구를 위해 핵으로 들여보내는 방법을 연구하기도 합니다. 이는 효율성을 높이는 등 생각보다 중요한 작업일 수 있죠.” 이 연구에 직접 참여하지 않았던 Rockefeller University의 세포생물학자인 Michael Rout의 말이다.

예전에 과학자들은 특정 분자가 핵의 경계를 넘도록 하는 NPC의 형태변화를 발견하였다. 하지만 이동하는 단백질 그 자체의 구조변화가 어떤 영향을 미치는지에 대해서는 알려진 바가 적었다. “운반되는 단백질은 장례식장의 시신처럼 보였다.-그들이 이 과정에 주인공이긴 하지만 능동적인 역할을하지는 못한다.” Rout의 말이다.

단백질의 모습과 움직임 사이에 관계를 연구하기 위해, Francis Crick Institute의 생물물리학자인 Sergi Garcia-Manyes과 학생들은 단백질이 핵으로 들어가는 시간을 재는 시스템을 개발했다. 그의 연구진은 항체단백질(Ig)을 재료로 선택했다. Ig의 두 가지 돌연변이를 주어 하나는 유연하게 하나는 단단하게 만들었다. 하지만 Ig에는 NLS이 없으니 NLS표식을 달아주는 것도 잊지 않았다. 이 돌연변이 단백질에 형광단백질을 연결하면 실시간으로 단백질의 이동을 볼 수 있다. 이제 연구자들은 이 재조합 단백질의 이동 속도를 측정할 준비가 되었고, 실험 결과 유연한 구도의 Ig domain이 단단한 구조보다 핵으로 들어가는데 걸리는 시간이 짧게 걸리는 것을 알 수 있었다.

Garcia-Manyes와 그의 연구진은 유연성이 NLS의 접근성에 영향을 주어 속도가 빨라진 것인지 알아보았다. 이 실험을 위해서는 정상 Ig유전자의 양끝에 유연성이 높은 R16단백질의 유전자를 붙여 실험하였다. 이렇게 유연한 부위를 NLS로부터 서로 다른 위치에 있도록 만든 두 단백질의 이동 속도를 비교한 것이다. 그 결과 유연한 부위가 NLS에 가까울수록 핵으로 빨리 들어가도록 만든다는 사실을 알았다.

Garcia-Manyes와 그의 동료들은 이렇게 유입 속도를 빠르게 만드는 것이 어디에 사용될 수 있는지 기능을 알아보았다. “우리 생각에는 단백질 자체의 성질을 유용하게 만들기 보다는 좀더 인공적인 것-예를 들면 분자를 설계하는 것-을 하기로 했습니다.” 이들은 단백질이 꺽이는 부분에서 흔히 발견되는 글라이신(Glycin, G), 세린(Serine, S) 다량체(GS)를 개발했다. GS하나는 거의 영향을 주지 않았고 25쌍 이상의 길이는 도리어 속도를 늦추었다. 2~4쌍 정도가 NPC를 통한 이동을 촉진하는 것으로 나타났다.

이 합성된 표식은 이동 속도를 약 2배 증가 시켰다. 하지만 변수가 있다. ”유연한 단백질의 경우는 거의 영향을 안 주었고, 아주 딱딱한 구조의 단백질에는 아주 강한 영향을 미쳤어요.” King’s College London의 생물리학자이자 동공 저자인 Rafael Tapia-Rojo의 말이다.

생물물리학자들은 실제로 자연계에서 그들의 이동을 돕기 위해 유연한 부위를 진화시킨 경우가 있는지 알고 싶었다. 예를 들면 핵단백질인 myocardin-related transcription factor A는 유연한 부위(부정형 not fixed structure)를 많이 가지고 있고 이것이 핵으로의 이동을 돕는 것일 수 있다. “다른 이동 단백질들의 위치 결정 신호 주위에 이런 유연한 구조를 갖는지 알아보는 것은 흥미운 일입니다.” Rout의 말이다.

앞으로의 실험에서 이런 단백질의 유연성이 핵 밖으로 나갈 때나 미토콘드리아 같은 세포내 소기관으로 단백질이 이동할 때 어떤 영향을 미치는지 알아볼 예정이다. “이는 특정 세포내 기관으로의 단백질 이동을 제어하는 기술로 발전할 수 있을 것입니다.”라고 Garcia-Manyes는 말했다.

<이 글은 아래의 기사를 번역한 것입니다.>

Kamal Nahas, PhD. 2024, Fast tracking protein delivery into the nucleus. The Scientist Aug 12, 2024

<원 기사의 참고문헌>

1. Lu J, et al. Types of nuclear localization signals and mechanisms of protein import into the nucleus. Cell Commun Signal. 2021;19(1):60.

2. Paci G, et al. Cargo transport through the nuclear pore complex at a glance. J Cell Sci. 2021;134(2):jcs247874.

3. Panagaki F, et al. Structural anisotropy results in mechano-directional transport of proteins across nuclear pores. Nat Phys. 2024;20(7):1180-1193.

4. Hakhverdyan Z, et al. Dissecting the structural dynamics of the nuclear pore complex. Mol Cell. 2021;81(1):153-165.e7.

5. Van Rosmalen M, et al. Tuning the flexibility of glycine-serine linkers to allow rational design of multidomain proteins. Biochemistry. 2017;56(50):6565-6574.

6. Infante E, et al. The mechanical stability of proteins regulates their translocation rate into the cell nucleus. Nat Phys. 2019;15(9):973-981.

새 연구에 따르면 세포막에 결합된 RNA분자가 호중구(neutropil)의 이동에 관여함을 확인하였다.

RNA는 세포 안에 머무는 일종의 집돌이 정도로 알려져 있다. 그래서 몇몇 종류의 세포에서 세포막 표면에 RNA분자가 발견되었을 때, 연구자들은 “무슨 목적이 있는 걸까?” 하고 의문을 가졌다. 최근의 연구가 그 목적 중 하나를 밝힌 것이다: 면역세포를 염증반응 지역으로 이동시키는 것이다.

지난달 Cell지에 발표된 논문에서, Yale University의 유전학자인 Jun Lu가 이끄는 연구팀의 약물학자인 Dianqing Wu는 어떻게 세포막 표면의 RNA가 호중구(neutrophil)를 혈관 내벽세포에 붙여 조직으로 빠져나가게 하는지 설명하였다(1). 이 분자를 제거하면 면역세포가 염증반응 지역으로 빠져나가는데 실패하였고, 이는 잠재적 위협에 대해 면역시스템이 어떻게 반응하는지를 보여준 것이다.

이 연구에 직접 관여하지 않았지만 glycoRNA의 존재를 밝혔던(3) Stanford University의 생화학자인 Carolyn Bertozzi에 따르면, 오랫동안 미스터리로 남았던 세포막 RNA가 지속적으로 관심을 갖고 연구하던 이들에게 마침내 보상을 주었다고 한다. “저는 이들이 (세포막 RNA를) 호중구의 작용을 매개하는 물질로 생각했다는 게 정말 흥미로웠습니다.”

세포막 표면의 RNA는 사람의 면역세포에서 처음 탐지된 2020년에야 알려지기 시작했다(2). 그 다음해에 Bertozzi의 연구팀은 암세포와 줄기세포에서 당사슬에 결합된 형태로 표면에 산재한 RNA를 발견하였다. 당단백질(glycoprotein), 당지질(glycoliid)과 마찬가지로 당RNA(glycoRNA)라고 이름 붙여진 이 새로운 분자는 면역 수용체에 붙어있어서 면역반응에서의 역할이 예상되었다.

Lu가 처음 이 논문을 접했을 때, 그의 반응은 비판적이었다. 즉, 그는 노출된 RNA분자는 어찌 되었든 혈액내 존재하는 RNA 분해 효소(RNase)에 의해 분해될 것이라고 생각한 것이다.

“이게 과연 가능 할까? 라고 고민했죠. 당시 처음 온 박사 후 연구원에게 2달 동안 이게 사실이 아님을 밝히고 그 뒤에 다른 주제로 넘어가라고 얘기할 정도였어요.”

그의 연구팀은 biotin로 표지된 당사슬에 결합하는 분자를 이용하여 호중구의 막 표면에 있는 모든 glycoprotein과 glycolipid, 그리고 아마도 glycoRNA까지 모두 표지를 달았다. 이렇게 표지된 세포에 세포막을 파괴하지 않고 일반 체내 농도보다 훨씬 고농도의 RNase를 처리한 후, 이 세포부터 RNA를 분리하였다. 만약 이 효소처리에 의해 RNA에 따라 나오는 biotin표식이 줄어들었다면, 세포 표면의 당사슬에 RNA분자가 붙어 있다는 증거가 될 것이다. 놀랍게도 표식은 없어 졌고 이는 glycoRNA가 세포 표면에 노출되어 있다는 것을 의미한다.

만약 glycoRNA가 glycoprotein이나 glycolipid와 비슷한 역할을 한다면, 아마도 면역세포의가 염증반응부위로 이동하는 것을 도울 것이다. 이를 입증하기 위해 호중구를 붉게 염색한 후 RNase를 이용하여 그들 막표면의 glycoRNA를 제거하였다. 또 다른 그룹은 녹색으로 염색한 후 표면 RNA를 제거하지 않았다. 이렇게 염색된 두 가지 호중구를 복부 염증이 있는 생쥐에 주사하였다. 그 결과 glycoRNA가 없는 세포들은 염증 부위에 도착할 확률이 떨어지는 것을 알 수 있었다.

조직에 침투하기 위해서는 우선 바깥쪽 세포에 결합하고, 이 후 몇 겹의 세포층을 통과해야 한다. Lu는 glycoRNA가 이 두 단계에 모두 관여하는지 궁금했고, 이를 위해 호중구를 배양중인 내피세포층의 한쪽에 위치시키고 반대편에 이들의 주화성물질을 넣어 보았다. GlycoRNA가 없는 호중구는 잘 결합하지 못했고 세포층을 통한 이동도 감소하였다. 이들은 내피세포층의 장벽이 없을 때는 정상적으로 이동하는 것으로 미루어 glycoRNA가 세포의 이동성에는 영향을 주지 않는 것을 알 수 있었다.

어떻게 glycoRNA가 내벽세포에 결합하는 것을 돕는지 알아보기 위해, 연구자들은 이 분자의 당과 RNA부분을 나누어 비교해보았다. 즉, 같은 세포배양 시스템에서 glycan을 과량 처리할 경우 면역세포의 내벽세포층을 통한 이동이 억제되었다. 반면 RNA를 과량 처리했을 때는 효과가 없었다. 이 발견은 - 다른 당결합 분자들과 마찬가지로 – glycoRNA의 당사슬 부위가 단단한 결합에 관여하고 RNA는 당사슬을 막표면에 가깝게 접근시키는 효과만을 갖는 다는 것을 나타낸다.

이 경우 RNA가 단순 구조물로서의 역할을 한다면 RNA의 염기서열은 중요치 않을 것이라고 설명한다. “염기서열의 기능에 대한 숨은 비밀이 있을 수 있겠죠.” Lu는 말한다. “이건 빙산의 일각에 불과 합니다.”

연구자들은 glycoRNA의 RNA가 내부에서 왔는지 또는 다른 죽은 세포에서 방출된 외부RNA에서 왔는지 알아보고자 하였다. 이를 위해 또 붉은 색과 초록색 2 가지 염색을 통해 호중구를 각각 염색하였고, 초록색으로 염색된 호중구에서만 glycoRNA를 화학적으로 표지하였다. 이 세포들을 섞어서 사흘 동안 배양하였고, 연구진은 오직 초록 세포에서만 표식을 발견할 수 있었다. 이는 RNA가 외부에서 들여온 것이 아니라 집안에서 만들어졌다는 것을 말한다.

GlycoRNA의 RNA를 분석해보면 라이보솜 RNA, transfer RNA, small nuclear RNA 등임을 알 수 있고 이는 비암호화 RNA의 재활용일 가능성을 제시한다. 이들 RNA들이 세포막으로 가는 규칙이나 어떻게 완전히 분해되지 않고 남아 있는지 등은 아직 분명치 않다.

Yale의 연구진들에겐 앞으로 계속 추궁해야 할 질문들이 있다. 각종 질병과 관련하여 glycoRNA에 변화가 있는지 연구할 계획이다. 하지만 이들을 실시간으로 분석할 기술이 없기에 어려움이 있을 것으로 예상된다. “여러 질문을 던지기 이전에 방법론적인 개선이 필요합니다.” Wu의 말이다.

<이글은 아래의 기사를 번역한 것입니다.>

Holly Barker, PhD, 2024, Cell surface RNA helps neutropils get around. The Scientist Apr 2, 2024.

<원 기사의references>

1. Zhang N, et al. Cell surface RNAs control neutrophil recruitment. Cell. 2024;187:846-860.

2. Huang N, et al. Natural display of nuclear-encoded RNA on the cell surface and its impact on cell interactions. Genome Biol. 2020;21,225.

3. Flynn RA, et al. Small RNAs are modified with N-glycans and displayed on the surface of living cells. Cell. 2021;184, 3109-3123.e22.

DNA 앱타머를 이용한 코카인, 헤로인, 그리고 펜타닐의 검출법-다른 약품과 섞여 있을 때도 가능하다.

North Carolina State University의 연구자들은 고성능 DNA aptamer를 이용한 코카인(cocain)과 다른 아편계 약물(opioid)에 대한 새로운 검출법을 개발했다. 이 검출기는 약품에 선택적이며 적은 양의 펜타닐(fentanyl), 헤로인(heroin), 그리고 코카인이 다른 약물과 섞여 있어도 감지할 수 있다. 이 검출기의 용도는 건강 관련업 종사자는 물론 법집행인 들에게도 매우 유용할 것이다.

“이 작업은 건강관련업이나 법집행부처에서 요구하는 개선된 검출법을 제공해줄 것입니다.”NC State의 화학과 부교수이며 이를 발표한 논문 2편의 공저자 이기도 한 Yi Xiao의 말이다.

“예를 들면 법집행기관에서 검출에 사용하고 있는 방법은 100년 가까이 오래된 화학반응을 통해 이루어지며 이는 선택성이 떨어져 그들이 확인하고자 하는 화합물이 아닐 수도 있다는 겁니다.” Xiao가 말을 이었다.

“그리고 현재 사용중인 코카인에 대한 aptamer는 선택적이지도 민감하지도 않아 혈액과 같은 생체조직에서 임상수준의 양을 검출할 수가 없슴니다. 하지만 우리가 개발한 검출기는 혈액내 코카인을 nanomolar 수준(이는 마이크로몰의 1/1000에 해당하는 농도이다)에서 검출할 수 있다는 거죠.”

각각 Journal of the American Chemical Society(JACS)와 JACS au에서 볼 수 있는 두 연구 결과에서, Xiao는 코카인, 헤로인, 코데인(codein), 펜타닐 그리고 다른 불법 약품들에 대한 aptamer-기반 검출기를 개발해 냈다.

앱타머(Aptamer)는 짧은 단일 가닥의 DNA 또는 RNA사슬로 특정 분자와 선택적으로 높은 친화력으로 결합한다. 즉, 다른 분자와는 결합하지 않는다는 것을 의미한다. 이 연구자들은 흥미를 갖는 물질을 임의로 만들어진 DNA 서열에 붙여보는 것으로 이 연구를 시작했다. 이렇게 어떤 aptamer가 이들 분자에 결합하는지 알아봤다.

“우리는 이 과정을 ‘bio-panning’이라고 불렀어요 왜냐하면 이건 강에서 금을 찾기 위해 강바닥 침전물을 후라이팬을 이용해 체질 하는 것과 비슷했기 때문이죠.” NC Satae의 대학원생이며 논문의 공동저자인 Obtin Alkhamis의 말이다. “일단 결합한 것과 결합하지 않은 것을 분리하면, 선택적으로 원하는 분자에만 결합하는지 확인하기 위해 그 aptamer를 다른 방해가 되는 분자들과 결합하는지 아주 심할 정도로 조사한 겁니다.”

그리고 이렇게 선택된 aptamer를 약물 복합체, 알약 그리고 혈액 등에 결합하는지 검사했다. 혹시 다른 약물이나 단백질등에 결합하는지 확인해본 것이다.

Xiao의 연구진은 혈청내 10 nanomolar (약 30 nanogram/mL의 농도) 수준의 cocaine을 검출하는데 성공하였다. 이는 예전에 50% 혈청액 속에 최저 10 micromolar 농도의 코카인을 검출할 수 있었던 과거의 aptamer보다 1000배 정도 민감한 것이다.

이에 더해 University of California Santa Barbara의 협력팀은 이 aptamer를 전극에 삽입할 수 있었고 이를 이용해 쥐의 혈액내 (정맥) 약물 농도를 10초 간격으로 실시간으로 측정할 수 있었다. 이는 남용 약물의 약물학적 측정이 가능하게 된 최초의 연구라고 할 수 있다.

아편-특이적 aptamer는 발색반응에 활용되어 용액내 헤로인, 옥시코돈(oxycodone) 등을 0.5 micromolar농도까지 측정할 수 있었다. 발색반응 정량은 표적 물질에 결합하면 색이 바뀌는 것이다. 이 정량법은 아편계물질이 복잡한 화학매질(알약이나 의약품 복합물 등)에 있어도 수 초 안에 검출할 수 있다.

비교하자면, 법조계에서 사용하는 “Marquis test”는 다른 화합과 섞여 있는 경우 아편을 검출할 수 없다.

이 연구자들은 이 aptamer가 건강분야나 법조계에 유용하게 활용될 것이라고 믿는다.

“이 aptamer들은 대량 생산이 가능합니다. 또한 보관 기간도 길고, 화학적 변형도 용이하여 개발중인 검출기에 쉽게 적용시킬 수 있습니다.” Xiao의 말이다. “이 물질들은 시험용지에 묻힐 수도 있어 현장에서 일하는 경찰들이나 가정에서나 또는 의사들이 환자에 대해서도 사용이 가능하게 만들 수 있죠.”

“임상 수준에서의 검출이 가능하기 때문에 응급실에서 환자가 어떤 약물을 복용 또는 투약했는지 피 한 방울로 알 수 있습니다. 예전에는 혈액을 채취하고 실험실에 보내야 가능했던 일이죠.” Alkhamis의 말이다. “사용 가능성에 정말 흥분됩니다.”

<이글은 아래의 기사를 번역한 것입니다.>

DNA aptamer drug sensors can instantly detect cocaine, heroin and fentanyl—even when combined with other drugs (2024, March 4) retrieved 8 March 2024 from https://medicalxpress.com/news/2024-03-dna-aptamer-drug-sensors-instantly.html

<원 기사의 refences>

More information: Obtin Alkhamis et al, High-Affinity Aptamers for In Vitro and In Vivo Cocaine Sensing, Journal of the American Chemical Society (2024). DOI: 10.1021/jacs.3c11350

Juan Canoura et al, Developing Aptamer-Based Colorimetric Opioid Tests, JACS Au (2024). DOI: 10.1021/jacsau.3c00801

Dorothy Shippen과 Borja Barbero는 국제 우주 정거장에서 애기장대풀(아라비돕시스, Arabidopsis thaliana)를 키우며 우주비행이 텔로미어에 어떤 영향을 미치는지 연구하였다. NASA는 쌍둥이 우주비행사 Scott과 Mark Kelly에 관한 연구를 통해 생물학적인 변화를 비교하여 2019년 발표하였다. Scott은 국제 우주 정거장(International Space Station, ISS)에서 일년간 보냈고 Mark는 지구에 머물렀다. 여러 차이 중에서, Scott의 텔로미어(telomere)가 우주 정거장에서는 길어졌다가 다시 지구로 돌아와서는 짧아진 것을 발견했다.

 Texas A&M University에서 식물의 telomere를 연구하던 생물학자인 Dorothy Shippen는 여기에 흥미를 느꼈다. Telomere는 환경에 따라 변하며 스트레스 환경에서 생물의 생존에 영향을 준다. 식물의 환경 스트레스에 대한 회복력은 미래에 우주에서나 현재 지구에서 농작물들이 겪는 어려움을 해결하는데 필수적인 요소라고 할 수 있다. 비록 여러 차례 식물들이 우주비행을 했지만 이들의 telomere에 대해서는 최근까지 알려진 것이 없었다. Shippen과 박사후 연구원인 Borja Barbero Barcenilla는 ISS에서 자란 애기장대풀(Arabidopsis thaliana)의 telomere를 연구하여 최근에 Nature Communications에 논문을 게재하였다. 이에 따르면 사람에서와 마찬가지로 우주선에서의 발아는 A. thaliana의 텔로미어를 합성하는 telomerase의 활성을 증가시켰다. 하지만 우주 비행사와는 달리 이 ISS 식물은 텔로미어의 길이가 늘어나지는 않았다. 

Q: 우주선에서의 식물 telomere에 대해서는 어떻게 연구를 시작하게 되었나요? 

Shippen: 쌍둥이 실험이 정말 개기가 되었어요, 하지만 우리에겐 우주로 식물을 보낼 방법이 없었죠. 호기심에서 NASA에 연락을 해서 혹시 우리가 telomere를 분석할 만한 식물 표본이 없는 지 물어봤죠. 마침 Ohio University에서 중력이 식물에 미치는 영향을 연구하던 Sara Wyatt와 그녀의 연구팀이 비행을 거친 샘플의 잉여분을 갖고 있었습니다. 우리는 Wyatt와 NASA에서 쌍둥이 연구를 주관했던 Colorado State University의 방사선 암 생물학자인 Susan Bailey와 함께 연구를 하게 되었죠. 우린 잉여 샘플을 분석하여 데이타를 얻었고 이후 귀환하는 샘플의 일부를 얻기도 했어요. 

Q: ISS 시료를 얻는데 특이 할만한 어려운 점이 있었나요? 

Barbero: 많은 문제가 있었죠. 추가로 샘플을 보내야 했는데, 접시마다 18개의 A. Thaliana개체가 심어진 배양접시가 60개나 되었어요. 이는 3, 4일 안에 준비하기엔 엄청 많은 거였죠. 저는 Wyatt의 실험실에 박사후 연구원이며 현재는 NASA에서 일하는 공동 저자인 Alexander Meyers를 도와 일했습니다. 일단 샘플이 지구에 도착하면, 우리는 잽싸게 줄기와 뿌리를 분리하고자 했어요. 왜냐하면 다른 조직은 다르게 반응했을 테니까요. 약한 중력 때문에 아무렇게나 막 자랐고; 뒤엉켜 있었어요. 이건 워낙 귀한 샘플이라 자르기가 겁났었죠. 냉동고에서 꺼내자마자 바로 잘랐습니다. 우린 Meyers를 Texas A&M으로 초대해서 우리의 해부를 도와달라고 했죠. 어려운 만큼 즐거웠던 시간입니다. 냉동고에서 샘플을 꺼내 실험을 준비하면서 생각했어요. “이것들은 우주에 있던 거네!”라며 싸한 느낌이 왔죠. 모든 실험은 놀라웠고 독특한 기회였어요. 이때는 이런 설레임과 망치지 말아야지 하는 다짐이 공존하던 때 입니다. 이 샘플 밖에는 없었기 때문이죠. 

Q: 결과 중에 놀라운 것이 있었나요? 

Barbero: 우린 telomere의 길이를 살펴봤고, 그 길이가 변하지 않았다는 것을 알곤 고민에 빠졌죠. 하지만 이건 예상보다 더 재미있는 결과였습니다. 왜냐하면 우주에서 날았던 모든 생물들의 telomere는 대부분 길어졌는데 식물은 아니었던 거죠. Shippen: 예전에 C. elegans를 우주에 보낸 적이 있었어요, 그리고 이들의 telomere가 사람처럼 길어졌죠. 사람의 telomere는 환경 변화나 생리적 변화에 따라 매우 유동적인 모습을 보여주곤 합니다. 식물을 여러 스트레스 상황에 두어도 대부분 telomere의 길이가 변치 않는 것을 볼 수 있었고 우주선에서 어떤 결과가 나올지는 사실 예측할 수가 없었죠. 길이가 변하지 않았다는 것은 아주 놀라운 일은 아니었지만 우리가 놀란 건 telomerase의 유도 정도 였습니다. 

Q: Telomere의 길이 변화 없이 telomerase의 활성 증가가 일어난 것이 왜 놀랄 일이죠? 

Shippen: 이는 telomere의 길이와 telomerase 활성이 서로 연결되어 있지 않다 것을 말합니다. 사람의 경우는 아주 상관관계가 높기 때문에 예상을 못한 거죠. 우린 스트레스 상황에서 telomerase의 활성 증가에 대해 좀더 넓게 생각하기 시작했습니다. 우리는 실험실에서 할 수 있는 여러 종류의 스트레스에 대해 A. Thaliana의 telomerase에 생기는 변화를 알아보는 보충 실험을 수행했고, 우린 역시 telomerase의 증가를 관찰했어요. 이 결과로 우리는 telomerase의 다른 역할에 대해 생각해보게 되었어요. 이는 이 분야에서 아직 논란이 되고 있는 가설입니다. 많은 과학자들이 telomerase의 telomere 합성 외의 기능에 대해 확신을 갖지 못하고 있는 상황이죠. 하지만 우리의 경우처럼 telomere의 길이 변화가 없이 급격한 효소 활성이 증가한다는 것은 이해하기가 어렵습니다. 

<이글은 아래의 기사를 번역한 것입니다.> 

Donna MacNeil, PhD., How plants protect their DNA in space. The Scientist Jan 24, 2024. 

<원문 references> 

1. Garrett-Bakelman FE, et al. The NASA Twins Study: A multidimensional analysis of a yearlong human spaceflight. Science. 2019;364(6436):eaau8650.. 

2. Barcenilla BB, et al. Arabidopsis telomerase takes off by uncoupling enzyme activity from telomere length maintenance in space. Nat Commun. 2023;14(1):7854.

생명공학적으로 만들어진 박테리아(bioengineered bacteria)를 CAR T cell이 암을 공격할 수 있도록 종양에 침투시킨다.

1890년 의사였던 William Coley는 어떤 암환자가 비슷한 시기에 박테리아에 감염된 뒤 자연 치유되었다는 사실을 알고 암 환자에게 박테리아를 주사하는시술을 했다. 그는 면역 활성화와 항암 작용을 처음 연관 지은 과학자였고 이로 인해 그에게 “면역치료의 아버지”라는 칭호가 주어진다. 임상에서의 몇 차례 성공이 있었으나 안전문제와 방사선치료의 발전으로 Coley’s toxin이라고 불리던 이 박테리아 묘약은 자취를 감추게 된다.

지난 수 십 년간 면역학, 미생물학, 그리고 합성생물학(synthetic biology)의 발전으로 암 치료에 생명공학적으로 변형된 박테리아(bioengineeredbacteria)의 사용에 대한 관심 다시금 커지고 있다. 최근 Science지에 발표된 논문에 따르면 이 bioengineered bacteria는 종양에서 군집을 형성하여, 유전자조작이 된 T 세포를 종양으로 유도하도록 설계되었다. 이 참신한 치료법은 단순히 bioengineered bacteria가 치료가 어려운 고형 종양(solid tumor)에 접근을 용이하게 하여 기존의 면역 치료를 도왔을 뿐 아니라, 살아있는 약재의 다양한 가능성을 보여주었다.

종양의 미세 환경은 쉽지 않은 생태계라고 할 수 있다. 하지만 “박테리아들은 이런 것에 신경 쓰지 않고 오직 신체의 면역시스템을 피해 살아갈 수 있는 환경이 절실하죠.” Columbia University의 합성 생물학자인 Tal Danino의 말이다.

고형 종양의 내부는 저산소 지역으로 가장 면역 감시가 적게 이루어지는 곳으로 박테리아에겐 좋은 집이 될 수 있다. 하지만 박테리아들은 아직 건강한 기관에서도 자리를 잡기 때문에 박테리아의 유전자를 조작하여 병 독성 또는 독성을 낮추는 방법을 모색해야 한다. 이렇게 약화된 박테리아는 생쥐나 사람에서 더 안전하다는 것이 입증되었으나 종양내 군집형성 능력이나 종양치료에 효과가 떨어지는 것을 알 수 있었다. 이에 종양 표적화와 선택성을 개선하기 위한 합성생물학적 해결책을 찾게 되었다.

Jeff Hasty와 Omar Din과 함께 Postdoc으로 일하던 Danino는 박테리아가 일정한 밀도 이상으로 자라면 쿼럼(quorum)현상(2023-06-17, 박테리아의 군체밀도 감지 참고)에 의해 동시에 용해(lysis)되도록 만드는 작은 유전자 고리를 개발하고 있었다. 이렇게 용해가 일어나면 세포내 유전자 산물들이 모두 쏟아져 나오게 된다. 몇몇 박테리아가 용해되지 않지만 다음 번 번식기에는 용해가 일어난다. “일종의 불완전한 시스템인데 도리어 이게 이 시스템의 아름다운 점이라고 할 수 있습니다.” Danino 연구팀의 대학원생이며 논문의 공동저자인 Rosa Vincent의 말이다. “이는 주기적인 전달 방법이라고 할 수 있죠.”

Danino는 이 진동성 유전자고리를 이용하여 의생물학적 문제를 해결하는데 흥미를 느껴 박테리아를 이용한 암 치료에 집중하게 된다. 박테리아는 이미종양에 들어가려는 성향이 있기에 그는 박테리아가 진단 또는 치료물질을 만들도록 생명공학적인 조작만 하면 되었다. 이는 마치 트로이 목마와 같은 것이다.

“박테리아를 이용해 특정 부위를 표지 한다는 것은 항원 이질성(antigen heterogeneity)에 따른 문제를 해결하는데 굉장히 좋은 해결책이 될 수 있어요.”Stanford University의 생명공학자인 Rogelio Hernández-López의 말이다. 고형 종양을 chimeric antigen receptor(CAR) T 세포와 같은 항원-표적치료로치료하기 어려운 이유 중 하나가 종양의 표면에 노출된 암 특이적 항원이 아주 적다는 것이다. 더구나 종양-관련 항원은 환자나 암의 종류에 따라 다르며,마치 의사들이 움직이는 과녁을 쏴야 하는 것처럼 돌연변이를 통해 표적치료를 피할 수도 있다.

“만약 적절한 항원이 없다면 우리가 어떻게 좋은 CAR를 만들 수 있겠어요.” CAR T cell의 논리-지향적 접근법에 참여했던 Vincent가 말을 이었다. 이런 문제는 그녀가 Danino의 박테리아에 대한 생명공학적 변형 작업에 참여하도록 만들었다.

트로이 목마를 만들기 위해, 연구자들은 Danino의 쿼럼 감지 용해회로를 갖는 대장균 Nissle 1917 품종(strain)에 생명공학적 변형을 시도했다. 일단 일정수준의 쿼럼에 도달하면 이들은 합성 항원을 분비하기 시작한다. 특수하게 초록형광단백질(green fluorescence protein, GFP)을 placental growth factor의헤파린 결합영역(Heparin binding domain, HBD)과 결합시킨 것이다. 잘 결합하는 HBD가 종양의 독특한 콜라겐과 다당류에 부착하고 GFP 깃발이 종양에 심어지는 것이다. 비록 이 분자가 건강한 조직에서도 발견되지만 이들은 종양에 훨씬 많다. “이 종양에 선택적인 박테리아에 전적으로 의존하는 겁니다.” Vincent의 말이다.

대부분의 FDA 승인을 받은 CART cell 치료법은 cluster of differentiation19(CD19)이라는 종양 항원을 표적으로 삼는다. 하지만 Vincent는 GFP 항원을 표적으로 하는 CAR을 디자인한 것이다. “우리는 종양을 푸른 색으로 칠하고 T 세포로 하여금 푸른색을 감지하도록 만든 겁니다.” 라고 말했다. “CAR의 아름다운 점은 모듈로 되어 있다는 점입니다. 그래서 항원결합분위를 다른 것으로 완전히 대체할 수 있다는 거죠.” 라고 Vincent는 말했다.

이들이 이 미생물 기반 CAR 시스템(probiotic CAR system)을 실험실에서 인간 암세포에 처리하면, GFP가 없는 시스템에 비해 특이성이나 세포독성이높게 나타난 것을 보았다. 이어진 실험실 연구에서 이들의 시스템은 이제 배양기 밖에서 시행에 옮길 준비가 되었음을 보여준다.

Probiotic CAR 프랫폼을 시험하는 첫 생체 실험으로, 사람의 종양조직을 피부아래 심은 면역결핍 생쥐를 이용했다. Engineered Bacteria를 직접 종양에주사한 후 quorum-related release가 일어나 GFP가 engineered CAR T cell을 주사하기 전에 발현되도록 48시간을 기다린다. 이렇게 시행된 engineeredprobiotic CAR system은 종양의 발달을 막았고 flow cytometry를 이용한 분석에서 T 세포의 활성이 증가한 것을 알 수 있었다.

연구자들은 부분적인 시스템은 부분적인 반응을 일으킨다는 것을 알아냈다. 즉, 빈(GFP가 없는) 박테리아를 주사해도, engineered CAR이 일부 작동하여일부 T 세포가 종양부위에서 활성화된 것이다. “제가 이 시스템에서 좋아하는 점은 T 세포가 정말 강하게 박테리아에 반응한다는 것입니다.” Vincent의 말이다. “이런 사실이 이들 박테리아 사용을 선호하게 만드는 겁니다. 이들이 탑재물을 내놓을 수도 있지만 이들은 선천적으로 (면역을) 자극할 능력이 있어차갑던 종양을 뜨겁게 만들 수 있죠.”

CAR T 세포의 증식과 지속성을 증가시키기 위해 환자는 혈액내 T 세포를 죽이는 림프구 제거(lymphodepletion)를 거쳐야 한다. 하지만 면역치료의 장기적인 목적은 온전한 면역체계에 적용하는 것이다. “아마도 우리는 전체 종양을 제거하기 위해 어느 한 항원에 대한 면역력 보다는 전체 면역 시스템의 도움이 필요할 것입니다.” 라고 Vincent는 말했다.

이들의 시스템을 온전한 면역 체계 안에서 실험해 보기 위해, Vincent와 그녀의 동료들은 쥐의 뒤쪽 양측면에 생쥐-유래 종양세포를 주사하였고 그중 하나에 engineered bacteria를 주사하였다. 이후 몇일 뒤에 다시 두 차례 CAR T 세포를 처리하였다(이는 T 세포가 소모되는 것을 방지하기 위해 잉여의CAR T 세포를 넣어주는 것이다). 이 연구자들이 바란 것은 이들의 시스템이 다른 반대편의 종양도 인식할 수 있을 정도로 충분한 염증반응을 유발하기를기대한 것이다. 그리고 그 결과로 처리한 종양과 함께 처리하지 않은 종양도 감소하는 것을 발견했을 때 흥분하지 않을 수 없었다.

피하주사 실험은 다음 실험을 준비하게 된다: 정맥주사를 통해 probiotic CAR system을 넣는 것이다. 이를 위해 사람의 암세포를 면역을 약화시킨 생쥐의젖선 지방질에 이식하고 이어 probiotic CAR 치료를 조금 변형하여 주입한 것이다. CAR T세포가 종양에 더 잘 가도록 만들기 위해 engineered bacteria가면역세포를 유도하는(주화성, chemotaxis) 사람 chemokine ligand 16(CXCL16)을 같이 분비하도록 만든 것이다. 이렇게 CAR T 세포가 종양을 향해 이동하도록 농도 기울기를 형성시킨다. 이 주화성 chemokine의 첨가는 종양의 성장을 억제한다는 면에서 일반적인 probiotic CAR system의 효과를 훨씬 능가하도록 시스템을 보강하였다. 이에 더해 다른 기관들을 분석한 결과 박테리아와 GFP의 발현은 종양부위에 국한되어 나타났다.

이런 실험을 사람에게 시도하기 전에 연구자들은 우선적으로 engineered bacteria가 계속 자라지 못하게 유전적으로 종결시켜야 한다. 이 실험에서는 야생형 대장균을 사용했지만 사람의 경우는 생쥐에 비해 gram negative 균의 독성에 더 민감하다. “이제 실험실의 주 관심은 어떻게 적합한 박테리아 품종을만드느냐에 있습니다.” 라고 Vincent가 말했다.

“이는 두 가지 별개의 생명공학적 시스템들이 상호 보완하여 시너지효과를 보여준 예라고 할 수 있습니다.” Hernández-López의 말이다. “(Danino는) 오랜기간 동안 박테리아 용해 회로를 발전 시켜왔고 이것이 다른 접근법과 합해지는 걸 본다는 건 기쁜 일입니다.”

Danino는 박테리아를 보면, 종양에 치료약을 전달하는 다양한 플랫폼과 그 밖에 다른 가능성까지 보게 된다. CAR T 효율을 높이기 위한 종양 미세환경재구성을 넘어서, 이 engineered bacteria가 PET나 MRI, 초음파, 그리고 약물전달을 위한 나노입자에 대해서도 도움을 줄 수 있을 것이라고 본다. “우리는다른 연구자들이 그들이 개발한 특정물질이나 다른 암 관련 물질들을 전달해 줄 수 있는 플랫폼을 만든다는 게 정말 흥미롭습니다.” Danino의 말이다.

“미생물에 대한 생명공학 기술들이 천천히 T 세포 분야의 기술들과 만나는 과정이고, 다음에 어떤 일들이 일어날지 기대되기도 합니다.” 라고 Hernández-López가 말했다.

<이 글은 아래의 기사를 번역한 것입니다.>

Danielle Gerhard, PhD, Bugs as drugs to boost cancer therapy. The Scientist Jan. 18, 2024

<원 논문>

Vincent RL, et al. Probiotic-guided CAR-T cells for solid tumor targeting. Science. 2023;382(6667):211-218.

인공지능 도구(artificial intelligence tool)인 scGPT가 세포의 종류를 알아내고, 유전자들의 결손 시 나타날 결과를 예측하며 특정 유전자들 간에 상호작용을 잡아낼 수 있다.

과학자들은 질병을 연구하기 위해 전체 세포집단의 유전자 발현을 연구한다. 예를 들면, 암과 관련된 약 개발을 위한 단백질 표적을 찾고 알츠하이머병의 초기 진단을 위한 혈액내 바이오 마커를 찾기 위해 RNA 염기서열분석(시퀀싱, sequencing)을 실시한다.

최근에 과학자들은 단일 세포 RNA 시퀀싱(single cell RNA sequencing, scRNA-seq)을 통해 단일 세포들 간에 유전자 발현에 어떤 차이가 나는지도 알 수 있다. 과학자들은 특히 scRNA-seq의 데이타를 머신 러닝 프로그램을 이용해 시작부터 특정한 일들을 수행하는 데까지 활용하고 있다.

Bo Wang은 University of Toronto의 생물학자이자 컴퓨터 생물학자로 single cell generative pretrained transformer(scGPT)라고 부르는새로운 AI 도구를 만들었다. 이 모델은 scRNA-seq의 데이타를 미세하게 조정하여 다양한 일들을 수행할 수 있다. 여기에는 특정한 유전자를 조작했을 때 나타날 영향을 예측하거나 데이터들을 합해서 알기 어려운 세포의 종류를 감정해내는 것 등이 포함된다.

scGPT는 기초가 되는 AI 도구이다. 이 핵심 모델을 이용하여 새로 구축하고 변형하여 하위 작업들을 수행할 수 있기 때문이다. 날로 인기 상승중인 대화형 AI, ChatGPT와 같은 방식으로 작동한다. ChatGPT는 답을 문장으로 내놓는 반면 scGPT는 세포수준에서의 유전자 발현을 예측한다.

Wang에 따르면 하나의 기초 모델을 플렛폼으로 사용하는 것은 서로 다른 분석 결과를 비교할 때 여러 모델을 이용한 것에 비해 잘못될위험이 적기 때문에 유리하다고 한다. 각 컴퓨터 분석에서는 같은 데이터라도 생성된 구조에 따라 다른 가설을 만들기 때문에 정확치못한 결론에 다다를 수 있다.

최근의 출판전 논문에서, Wang의 연구진은 기존의 방법들에 비해 scGPT가 scRNA-seq을 잘 분석 한다는 것을 보여주었다. 그들은 최초 4일간 혈액과 골수 세포에서 얻은 일천삼십만개의 scRNA-seq 데이터를 입력하여 scGPT를 학습 시켰다. 여기에는 50개 이상의 세포 종류가 포함되어 있다. 이는 AI가 세포 안에서 또는 세포 간에 유전자 발현이 어떻게 근본적으로 연결되었는 지를 배울 수 있게 했다.

주어진 세포에서 모든 유전자가 발현되고 있는 것은 아니기 때문에 각 세포는 20,000개 유전자 중 수 천개에 대한 정보를 제공한다. 이들을 종합한 결과 유전체 내의 거의 모든 유전자에 대한 정보를 갖게 되었다. 이 연구진은 예전에 얻은 사람의 면역세포에서 얻은 10가지 서로 다른 scRNA-seq 데이터 덩어리를 통합해서 기초 모델을 세밀하게 조정할 수 있었다. 각 데이터의 일부를 이용하여 학습시켜 서로 다른 데이터에서 보다 일반화된 집단으로 같은 세포를 분류할 수 있도록 하였다. scGPT는 각 데이터군 간에 비생물학적인 요인에 의한 차이도 적용하도록 배웠다. 예를 들면 시행된 날자, 세포를 수획한 방법 등이다. 데이터군 통합(batch integration)으로 알려진 이 방식으로 데이터 베이스를 모아 거의 모든 세포 종류에 대해 다량의 데이터를 모을 수 있고, 이를 이용해 건강하거나 아플 때 관여하는 희귀한 세포들을 감지하고 밝힐 수 있게 해줄 것이다. 

연구자들은 이렇게 미세조정된 scGPT와 가장 많이 사용되는 3 가지 방법이 합쳐져 감춰두었던 데이터를 얼마나 잘 다루는지 알아보았다. scGPT는 각기 다른 데이터 집단에서 표준 모델보다 약 5% 더 효율적으로 세포종류를 분류하였고 많이 이용되는 방법과 유사한 정도로 비생물학적인 영향을 고쳐낼 수 있었다.

연구진은 또 다른 잘 다듬어진 scGPT인, GEARS라고 부르는 표준 모델과 비교하여 80여개 유전자를 변동시켰을 때 단독 또는 쌍으로다른 유전자에 미치는 영향을 얼마나 잘 예측하는지 비교하였다. 각 유전자 조작에 따라 가장 영향을 많이 받는 20개 유전자들에 집중하였고, Wang과 동료들은 scGPT가 가장 앞선다는 것을 발견하였다.

“이런 진전이 정말 생물학적 지식을 더해주는 걸까요? 새로운 가설을 세우는데 유용할까요?” 이 연구에 직접 관여하지 않았던 네덜란드의 Leiden University Medical Center의 컴퓨터 생물학자인 Ahmed Mahfouz의 질문이다.

이런 발견은 분명해 보이지만 Mahfouz는 여기에는 수백만가지의 변수가 있고 훈련에는 엄청나게 많은 데이터가 필요하다고 조심스럽게 언급했다. 결과적으로 이들은 엄청난 양의 에너지를 소모해야하고 엄청난 양의 탄소 산물이 남기게 될 것이다. 이런 고에너지 요구량과 연구자들이 세밀한 조정을 위해 머신러닝과 친숙 해져야 한다는 점을 고려할 때, 세포생물학자 들에게 scGPT가 얼마나 사용될지는 의문이다.

그럼에도 불구하고 “미세조정은 아주 효울적입니다.” Wang의 말이다. “예를 들어 10,000 에서 20,000개의 세포에 대한 데이터를 처리하는 데는 약 5 내지 10분 정도 걸립니다.” 이들은 scGPT를 사용자들이 보다 쉽게 접근할 수 있게 만들기를 원한다. “우리는 모든 사람이 이용할 수 있는 code와 모델을 만들었고 교육용 web site를 만들기 위해 정말 열심히 일하고 있습니다. 이를 통해 수많은 사용법 교육과 이를 이용해 풀 수 있는 작업들에 대한 실질적인 예를 제공할 것입니다.”라고 말했다.

Wang의 연구팀은 계속 scGPT에 대한 작업을 계속할 예정이다. 이 모델의 첫 시도는 골수와 면역세포를 분석하는데 유용한 반면, 이팀이 최근에 발표한 scGPT 업그레이드 모델은 3천3백만 세포의 세포를 이용해 훈련이 이루어졌다. 여기에는 뇌, 혈액, 췌장, 폐, 심장,신장, 암 그리고 장의 세포들이 포함된다.

최근에는 scGPT와 비슷한 기초가 될 모델들이 발표되었고 어떤 것이 연구에 많이 활용될지 곧 알게 될 것이다. Mahfouz는 멀지 않은미래에 scGPT와 같은 모델들이 생물학의 중요한 질문들에 답을 줄 것이라고 예측하며, 이는 오직 시간이 입증해 줄 것이다. “지금은 흥미로운 시기입니다. 올해가 끝날 때쯤이면 지금과는 사뭇 다른 그림을 보게 될 것입니다.”

<이글은 아래의 기사를 번역한 것입니다.>

Carissa Wong, PhD., A new AI tool predicts gene expression in a single cell. The Scientist Aug 21, 2023.

Prime Editing 기술은 2019년에 발표된 이후 빛의 속도로 발전하고 있다. 과연 어떤 일들을 해 낼 수 있을까?

CRISPR는 아마도 현존하는 가장 인기있는 유전자 편집 기술일 것이다. 하지만 분명해보이는CRISPR의 성공에도 불구하고 이 과정에서 생기는 DNA의double-stranded break가 원치 않는 위험한 편집으로 이어지지 않을까 걱정되는 부분이 있다. 이와 함께 방법에 따라서는 염기편집에 필요한 단일 염기의치환에 비해 큰 변화를 필요로 하는 경우가 있다. 프라임 에디팅(Prime Editing)은 DNA분자의 두 가닥 모두를 자르지 않고도 단일 염기 수준의 정확도로표적을 편집할 수 있어 새로운 해결책이 될 수 있다.

이 기술의 고안자인 Andrew Anzalone과 David Liu가 2019년에 처음 발표한 이후, 이들은 다음 세대의 기술로 발전시켰고 회사를 만들어 처음으로 임상전 결과들을 내기 시작했다. 이제 prime editing은 마지막 목표, 즉 치료의 길로 향해 가는 셈이다.

Prime Editing은 어떻게 작동할까?

Prime editing은 prime editing guide RNA(pegRNA)와 Cas9 효소와 역전사효소(reverse transcriptase)를 결합시킨 단백질로 구성되어 있다. Prime editing에 사용된 CAS9은 원래 가지고 있던 두개의 nuclease(DNA분해효소) 부위 중 하나를 불활성화 시켜 ‘nickase’, 즉 한 가닥 만을 잘라 nick(잘린 부위를 말함)을 만든다. 따라서 pegRNA가 한쪽 DNA에 결합하면 CAS9에 의해 잘린 가닥의 일부가 밖으로 삐져나온다(flap).

pegRNA의 다른 한쪽 끝은 주형의 역할을 한다: 일부는 삐져나온 부분과 상보적이고 나머지 부위는 편집된 염기서열을 지니고 있다. 삐져나온 부위와pegRNA일부가 결합한 후 역전사효소에 의해 pegRNA를 주형으로 원하는 DNA염기서열이 만들어진다. 이렇게 만들어진 조각은 다시 원래의 DNA분자에 끼어들어간다. 상보적인 가닥의 2번째 nick의 도움으로 원래의 가닥은 제거되고, DNA 손상회복 기전에 의해 다른 가닥도 원하는 염기서열로 바뀌게 된다.

Broad Institute에서 Liu의 실험실에서 일하는 동안, Anzalone은 실험관에서의 유전자 편집에는 성공했다. 하지만 인간 세포에서의 첫 실험은 실패했다. 그는 아마도 flap(삐져나온 부위)와 결합하는 pegRNA의 길이에 문제가 있었다고 생각했다. 다음 실험에서 그는 시험관에서 사용한 것에 비해 단 한 개의 염기를 더 붙여 실험하게 되었다. “그 단 하나가 백그라운드 편집 확률보다 높게 나오게 한 것 같았죠.”라고 말했다. 마침내 2019년에 그는 유전자 편집에 있어 믿을 만한 기술을 확보하게 되었다. 그는 좀더 긴 결합서열을 이용해 실험을 반복했고, “그때 저는 실험실에 있었어요 – 아마 수요일이었던 것 같습니다. – 내가 있던 Broad Institute에는 몇 명의 사람들이 더 있었습니다. 그들은 내 어깨 너머로 데이터를 분석하는 과정과 마침내 유전자 편집 성공률(%)이 한자릿 수를 보이기 시작한 걸 보았죠. 아주 흥분된 하루였습니다.”라고 말했다. Nature에 게재된 이 논문을 심사했던 University of California, Berkeley의 생물공학자인 Fyodor Urnov는 “제가 무엇보다 놀란 것은 이것이 대표하는 주제의 놀라운 확장성입니다.”라고 말했다. 이어 “우리가 자연으로부터 무언가를 원한다면 자연과 싸울게 아니라, 협동해야 하는 겁니다.”라고 말했다.

Twin prime: 차세대의 prime editor

최초의 prime editing은 단일 염기 치환에서 십여 개 염기의 삽입이나 제거에 이르는 비교적 작은 돌연변이에 집중되었고, 질병과 관련된 긴 서열을 고치기는 불가능했다. 결국 Anzalone, Liu 그리고 동료들은 twin prime editing을 들고나오게 된다. Twin prime editing이란 이름은 수학의 twin prime conjecture에서 따온 이름으로 소수(prime number)가 무한한 것처럼 소수의 쌍, 즉 17과 19처럼 p, p+2의 관계를 갖는 수도 무한하다는 추측이다. Anzalone의 동료중 수학을 전공하는 친구가 있었고, “재미있는 생각인 것 같아요.”라고 말했다.

Twin prime editing을 위해서 Anzalone과 Liu는 2개의 pegRNA를 이용했다. 가운데가 겹치는 2개의 삐져나오는 부위(flap)를 만들어 각각 다른 pegRNA에의해 반반씩 만들어지도록 하여 보다 큰 DNA부위를 편집하는 것이다. 하지만 이 twin prime editing 방법을 써도 100 bp이상의 긴 DNA 조각을 넣는 것은 어렵다. 이를 해결하기 위해 이들은 중간에 또 다른 부위를 삽입했다:특정부위 재조합효소(site-specific recombinase)이다. 자연계에서 이 효소는 DNA의 특정 부위를 인식하여 자르고 큰 조각을 붙인 뒤 다시 연결한다.Anzalone과 Liu의 연구팀에겐 이런 능력을 가진 효소를 twin prime editing의 삽입 능력을 향상시키는데 사용하는 것이 완벽해 보였다.

이들은 이 효소의 자리 인식에 twin prime editing을 사용하기로 하였다. Anzalone과 Liu가 함께 설립하고 현재 Anzalone이 일하고 있는 Prime Medicine사는 이 prime assisted site specific integrase gene editing을 bulked-up twin prime editing system PASSIGE라고 이름 붙였다. “이것으로 유전자 크기의 조합이 가능해졌습니다.” Anzalone의 말이다.

Anzalone과 Liu는 PASSIGE를 이용해서 작거나, 중간 또는 큰 수준의 편집이 가능한 prime editing의 도구를 만들어낸 것이다. 다음 단계는 분명해 보인다. 어떻게 이를 이용해 새로운 유전자 치료법을 개발해 내는가 하는 것이다.

Prime editing의 전망

여러 prime editing system이 있지만 치료를 위한 prime editing의 개발은 다른 유전체 편집에 비해 어려울 수 있다. “이는 원조 CRISPR-Cas9 system이나RNA를 사용한 표적부위의 염기 편집처럼 간단하지는 않습니다.” Anzalone의 말이다. “Prime editing에서 guide sequence에 대한 다양한 조작과 변형을주어 편집 효율에 있어 정말 큰 차이를 만들어냈습니다.”

편집 효율을 높이는 것에 어려움이 있긴 하지만 이걸 이유로 몇몇 질환들에 대한 Prime Medicine을 멈추게 할 수는 없었다. 그들은 ex vivo 프로그램에서만성 육아종병(chronic granulomatous diseases, CGD; 식세포의 기능이 떨어져 지속적인 감염증이 나타나는 면역결핍질환으로 유전병으로 알려져 있다.)을 치료하는데 가장 앞서 나가고 있다. “우리는 굉장히 믿을 만한 전임상 결과들을 갖고 있습니다.” Anzalone이 말했다.

Anzalone은 아직 시작에 불과하다고 생각한다. “점돌연변이를 교정하는 것을 넘어서, 반복부위 확장(repeated region expansion)으로 인한 질병, 예를 들면 허딩턴병(Huntington’s disease)이나 프리드리히형 실조증(Friedreich’s ataxia)에 대해 질병유발 반복부위를 제거하여 환자들에게 유효한 영향을 줄 수있다고 생각합니다.” 그는 또한 암을 제거하는 CAR-T 세포를 만들 수도 있다고 한다. “아직 우리의 진행 계획에 올라와 있지도 않지만 말이죠.”

Urnov는 이 과정이 매우 흥미롭고 Prime Medicine을 환자에게 빨리 적용해보는 것이 급선무라고 한다. “prime editing이 해야할 일은 그들이 제시한 계획에 따라 이 기술을 이용하여 본보기로 한 두가지 질환에 대한 발전을 강행해야 할 필요가 있습니다.”라고 말했다.

그는 Anzalone과 그의 연구팀이 환자를 도울 어떤 변환작업을 하는 대신 기술적 완성에 집중하는 것을 보고 싶지는 않다고 했다. “임상에 적용할 때까지기술의 잠재력과 안전을 위해 최적화 할 수 있다는 생각은 이 분야에서는 옳은 태도가 아닙니다.”라고 말한다. 그의 의견에 따르면 만약 제한 기준에 맞고환자들에 관해서도 투명하다면 그것으로 충분하다는 것이다. “prime editing의 적용을 기다릴 이유는 없다고 생각해요.”

Anzalone은 Prime Medicine이 두 가지 목표를 모두 이루기를 바라고 있다. 그는 prime editing의 혜택을 최대한으로 끌어올리는 방법으로 소위 “marchingup the chromosome (염색체 행진)”이라고 부르는 방법을 생각한다. 즉, 가장 보편적인 환자 집단에 하나의 돌연변이를 넣고 결과에 따라 각기 다른pegRNA를 이용해 2번, 3번 시도를 계속하는 것이다. 다른 하나는 “long flap” system을 이용해 환자집단에서 볼 수 있는 특정한 엑손의 모든 돌연변이를한번에 대치하는 것이다. “하나의 치료제가 한 환자가 아니라 많은 수의 환자를 치료하는 거죠.”라고 말한다.

이런 희망사항들이 결실을 맺기 까지는 많은 시간이 필요할 것이다. 그 동안 그는 그들이 개발한 기술을 더욱 발전시킬 것이다. 하지만 이런 과정에서 새로운 기술이 선호되고 전략화되기가 얼마나 어려운지 보여주기도 한다. 어느 질병을 택할 것인가? 누가 최초로 시도할 것인가? 이런 질문들은 쉽게 답할수 없는 것들이다.

“새로운 생명과학기술의 경우는 (목표에 도달하기 위해서) 얼마나 많은 것들을 해야하는지 파악하는 것입니다.” Anzalone은 말한다. “이곳의 모든 사람들은 (이 모든 것들이) 어떻게 될지 보고 싶죠. 만약 우리가 그런 위치에 갈 수 없다면 창피한 일이 될 겁니다.”라며 말을 맺었다.

<이글은 아래의 기사를 번역한 것입니다.>

Ida Emilie Steinmark, PhD., Prime editing comes of age. The Scientist Sep 8, 2023

<References>

1. Kosicki M, et al. Repair of double-strand breaks induced by CRISPR-Cas9 leads to large deletions and complex rearrangements. Nat Biotechnol.2018;36(8):765-771.

2. Anzalone AV, et al. Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA. Nature. 2019;576(7785):149-157.

3. Anzalone AV, et al. Programmable deletion, replacement, integration and inversion of large DNA sequences with twin prime editing. Nat Biotechnol.2022;40(5):731-740.

4. Zhao Z, et al. Prime editing: advances and therapeutic applications. Trends Biotechnol. 2023.