Prime Editing 기술은 2019년에 발표된 이후 빛의 속도로 발전하고 있다. 과연 어떤 일들을 해 낼 수 있을까?

CRISPR는 아마도 현존하는 가장 인기있는 유전자 편집 기술일 것이다. 하지만 분명해보이는CRISPR의 성공에도 불구하고 이 과정에서 생기는 DNA의double-stranded break가 원치 않는 위험한 편집으로 이어지지 않을까 걱정되는 부분이 있다. 이와 함께 방법에 따라서는 염기편집에 필요한 단일 염기의치환에 비해 큰 변화를 필요로 하는 경우가 있다. 프라임 에디팅(Prime Editing)은 DNA분자의 두 가닥 모두를 자르지 않고도 단일 염기 수준의 정확도로표적을 편집할 수 있어 새로운 해결책이 될 수 있다.

이 기술의 고안자인 Andrew Anzalone과 David Liu가 2019년에 처음 발표한 이후, 이들은 다음 세대의 기술로 발전시켰고 회사를 만들어 처음으로 임상전 결과들을 내기 시작했다. 이제 prime editing은 마지막 목표, 즉 치료의 길로 향해 가는 셈이다.

Prime Editing은 어떻게 작동할까?

Prime editing은 prime editing guide RNA(pegRNA)와 Cas9 효소와 역전사효소(reverse transcriptase)를 결합시킨 단백질로 구성되어 있다. Prime editing에 사용된 CAS9은 원래 가지고 있던 두개의 nuclease(DNA분해효소) 부위 중 하나를 불활성화 시켜 ‘nickase’, 즉 한 가닥 만을 잘라 nick(잘린 부위를 말함)을 만든다. 따라서 pegRNA가 한쪽 DNA에 결합하면 CAS9에 의해 잘린 가닥의 일부가 밖으로 삐져나온다(flap).

pegRNA의 다른 한쪽 끝은 주형의 역할을 한다: 일부는 삐져나온 부분과 상보적이고 나머지 부위는 편집된 염기서열을 지니고 있다. 삐져나온 부위와pegRNA일부가 결합한 후 역전사효소에 의해 pegRNA를 주형으로 원하는 DNA염기서열이 만들어진다. 이렇게 만들어진 조각은 다시 원래의 DNA분자에 끼어들어간다. 상보적인 가닥의 2번째 nick의 도움으로 원래의 가닥은 제거되고, DNA 손상회복 기전에 의해 다른 가닥도 원하는 염기서열로 바뀌게 된다.

Broad Institute에서 Liu의 실험실에서 일하는 동안, Anzalone은 실험관에서의 유전자 편집에는 성공했다. 하지만 인간 세포에서의 첫 실험은 실패했다. 그는 아마도 flap(삐져나온 부위)와 결합하는 pegRNA의 길이에 문제가 있었다고 생각했다. 다음 실험에서 그는 시험관에서 사용한 것에 비해 단 한 개의 염기를 더 붙여 실험하게 되었다. “그 단 하나가 백그라운드 편집 확률보다 높게 나오게 한 것 같았죠.”라고 말했다. 마침내 2019년에 그는 유전자 편집에 있어 믿을 만한 기술을 확보하게 되었다. 그는 좀더 긴 결합서열을 이용해 실험을 반복했고, “그때 저는 실험실에 있었어요 – 아마 수요일이었던 것 같습니다. – 내가 있던 Broad Institute에는 몇 명의 사람들이 더 있었습니다. 그들은 내 어깨 너머로 데이터를 분석하는 과정과 마침내 유전자 편집 성공률(%)이 한자릿 수를 보이기 시작한 걸 보았죠. 아주 흥분된 하루였습니다.”라고 말했다. Nature에 게재된 이 논문을 심사했던 University of California, Berkeley의 생물공학자인 Fyodor Urnov는 “제가 무엇보다 놀란 것은 이것이 대표하는 주제의 놀라운 확장성입니다.”라고 말했다. 이어 “우리가 자연으로부터 무언가를 원한다면 자연과 싸울게 아니라, 협동해야 하는 겁니다.”라고 말했다.

Twin prime: 차세대의 prime editor

최초의 prime editing은 단일 염기 치환에서 십여 개 염기의 삽입이나 제거에 이르는 비교적 작은 돌연변이에 집중되었고, 질병과 관련된 긴 서열을 고치기는 불가능했다. 결국 Anzalone, Liu 그리고 동료들은 twin prime editing을 들고나오게 된다. Twin prime editing이란 이름은 수학의 twin prime conjecture에서 따온 이름으로 소수(prime number)가 무한한 것처럼 소수의 쌍, 즉 17과 19처럼 p, p+2의 관계를 갖는 수도 무한하다는 추측이다. Anzalone의 동료중 수학을 전공하는 친구가 있었고, “재미있는 생각인 것 같아요.”라고 말했다.

Twin prime editing을 위해서 Anzalone과 Liu는 2개의 pegRNA를 이용했다. 가운데가 겹치는 2개의 삐져나오는 부위(flap)를 만들어 각각 다른 pegRNA에의해 반반씩 만들어지도록 하여 보다 큰 DNA부위를 편집하는 것이다. 하지만 이 twin prime editing 방법을 써도 100 bp이상의 긴 DNA 조각을 넣는 것은 어렵다. 이를 해결하기 위해 이들은 중간에 또 다른 부위를 삽입했다:특정부위 재조합효소(site-specific recombinase)이다. 자연계에서 이 효소는 DNA의 특정 부위를 인식하여 자르고 큰 조각을 붙인 뒤 다시 연결한다.Anzalone과 Liu의 연구팀에겐 이런 능력을 가진 효소를 twin prime editing의 삽입 능력을 향상시키는데 사용하는 것이 완벽해 보였다.

이들은 이 효소의 자리 인식에 twin prime editing을 사용하기로 하였다. Anzalone과 Liu가 함께 설립하고 현재 Anzalone이 일하고 있는 Prime Medicine사는 이 prime assisted site specific integrase gene editing을 bulked-up twin prime editing system PASSIGE라고 이름 붙였다. “이것으로 유전자 크기의 조합이 가능해졌습니다.” Anzalone의 말이다.

Anzalone과 Liu는 PASSIGE를 이용해서 작거나, 중간 또는 큰 수준의 편집이 가능한 prime editing의 도구를 만들어낸 것이다. 다음 단계는 분명해 보인다. 어떻게 이를 이용해 새로운 유전자 치료법을 개발해 내는가 하는 것이다.

Prime editing의 전망

여러 prime editing system이 있지만 치료를 위한 prime editing의 개발은 다른 유전체 편집에 비해 어려울 수 있다. “이는 원조 CRISPR-Cas9 system이나RNA를 사용한 표적부위의 염기 편집처럼 간단하지는 않습니다.” Anzalone의 말이다. “Prime editing에서 guide sequence에 대한 다양한 조작과 변형을주어 편집 효율에 있어 정말 큰 차이를 만들어냈습니다.”

편집 효율을 높이는 것에 어려움이 있긴 하지만 이걸 이유로 몇몇 질환들에 대한 Prime Medicine을 멈추게 할 수는 없었다. 그들은 ex vivo 프로그램에서만성 육아종병(chronic granulomatous diseases, CGD; 식세포의 기능이 떨어져 지속적인 감염증이 나타나는 면역결핍질환으로 유전병으로 알려져 있다.)을 치료하는데 가장 앞서 나가고 있다. “우리는 굉장히 믿을 만한 전임상 결과들을 갖고 있습니다.” Anzalone이 말했다.

Anzalone은 아직 시작에 불과하다고 생각한다. “점돌연변이를 교정하는 것을 넘어서, 반복부위 확장(repeated region expansion)으로 인한 질병, 예를 들면 허딩턴병(Huntington’s disease)이나 프리드리히형 실조증(Friedreich’s ataxia)에 대해 질병유발 반복부위를 제거하여 환자들에게 유효한 영향을 줄 수있다고 생각합니다.” 그는 또한 암을 제거하는 CAR-T 세포를 만들 수도 있다고 한다. “아직 우리의 진행 계획에 올라와 있지도 않지만 말이죠.”

Urnov는 이 과정이 매우 흥미롭고 Prime Medicine을 환자에게 빨리 적용해보는 것이 급선무라고 한다. “prime editing이 해야할 일은 그들이 제시한 계획에 따라 이 기술을 이용하여 본보기로 한 두가지 질환에 대한 발전을 강행해야 할 필요가 있습니다.”라고 말했다.

그는 Anzalone과 그의 연구팀이 환자를 도울 어떤 변환작업을 하는 대신 기술적 완성에 집중하는 것을 보고 싶지는 않다고 했다. “임상에 적용할 때까지기술의 잠재력과 안전을 위해 최적화 할 수 있다는 생각은 이 분야에서는 옳은 태도가 아닙니다.”라고 말한다. 그의 의견에 따르면 만약 제한 기준에 맞고환자들에 관해서도 투명하다면 그것으로 충분하다는 것이다. “prime editing의 적용을 기다릴 이유는 없다고 생각해요.”

Anzalone은 Prime Medicine이 두 가지 목표를 모두 이루기를 바라고 있다. 그는 prime editing의 혜택을 최대한으로 끌어올리는 방법으로 소위 “marchingup the chromosome (염색체 행진)”이라고 부르는 방법을 생각한다. 즉, 가장 보편적인 환자 집단에 하나의 돌연변이를 넣고 결과에 따라 각기 다른pegRNA를 이용해 2번, 3번 시도를 계속하는 것이다. 다른 하나는 “long flap” system을 이용해 환자집단에서 볼 수 있는 특정한 엑손의 모든 돌연변이를한번에 대치하는 것이다. “하나의 치료제가 한 환자가 아니라 많은 수의 환자를 치료하는 거죠.”라고 말한다.

이런 희망사항들이 결실을 맺기 까지는 많은 시간이 필요할 것이다. 그 동안 그는 그들이 개발한 기술을 더욱 발전시킬 것이다. 하지만 이런 과정에서 새로운 기술이 선호되고 전략화되기가 얼마나 어려운지 보여주기도 한다. 어느 질병을 택할 것인가? 누가 최초로 시도할 것인가? 이런 질문들은 쉽게 답할수 없는 것들이다.

“새로운 생명과학기술의 경우는 (목표에 도달하기 위해서) 얼마나 많은 것들을 해야하는지 파악하는 것입니다.” Anzalone은 말한다. “이곳의 모든 사람들은 (이 모든 것들이) 어떻게 될지 보고 싶죠. 만약 우리가 그런 위치에 갈 수 없다면 창피한 일이 될 겁니다.”라며 말을 맺었다.

<이글은 아래의 기사를 번역한 것입니다.>

Ida Emilie Steinmark, PhD., Prime editing comes of age. The Scientist Sep 8, 2023

<References>

1. Kosicki M, et al. Repair of double-strand breaks induced by CRISPR-Cas9 leads to large deletions and complex rearrangements. Nat Biotechnol.2018;36(8):765-771.

2. Anzalone AV, et al. Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA. Nature. 2019;576(7785):149-157.

3. Anzalone AV, et al. Programmable deletion, replacement, integration and inversion of large DNA sequences with twin prime editing. Nat Biotechnol.2022;40(5):731-740.

4. Zhao Z, et al. Prime editing: advances and therapeutic applications. Trends Biotechnol. 2023.