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실험실 실험

​생명공학 Biotechnology

유전자를 다루는 기술로부터 시작된 생명공학 기술은 도저히 풀 수 없을 것 같았던 생명과학계의 수 많은 난제를 해결하는데 혁혁한 공을 세웠다. 대표적인 예가 인슐린이라고 할 수 있다. 화학적으로 합성하기엔 너무 크고 다른 대체 물질을 찾기 어려운 호르몬들은 유전공학적인 방법이 아니고는 일반인에겐 사실상 그림의 떡이 었다.  돼지나 소에서 얻는 방법이 있었는데, 일회 투여량을 얻기 위핸 수백마리의 동물이 필요했고 또 순수하게 분리해내는 과정도 쉽지가 않았다. 잘 못하면 다른 호르몬이나 단백질이 섞여들어가 심각한 합병증을 유발할 수 있기 때문이다. 하지만 현재는 유전공학적인 방법으로 미소량이 존재하는 호르몬들을 다량으로 값싸게 공급할 수 있게 된 것이다. 이 밖에도 아주 다양한 방법으로 활용되어 우리의 건강을 지키고 치료하는데 사용되고 있다. 어쩌면 이런 생명공학적 기술의 발달이 생물의 신비를 풀어낼 수 있는 거의 유일한 해법일 수 있다. 

이 곳에는 어떻게 우리 생활에 필요한 물질들을 만들고 연구하는지 생명공학의 기술을 중심으로 한 글들을 모아 소개하였다. 

Biotechnology 2024 Topics

biotechnology

cell biology

세포막 표면 RNA가 호중구(neutrophil)의 이동을 돕는다

세포의 세계는 아직 우리에겐 생소한 것이 많은 것 같습니다. 세포가 보여주는 기발하고 절묘한, 상식을 깨는 자유로운 적응 형태를 보면서 감탄할 때가 많죠. 지질 이중 층으로 구성된 세포막은 가운데 소수성부위가 존재하고 여기에 끼어들어가 있는 막단백질이나 지질 분자에 탄수화물가지가 붙어 각각 당단백질(glycoprotein)과 당지질(glycolipid)을 형성합니다. 이들은 세포 간 결합에 작용하며 면역세포가 염증반응 지역으로 이동하는 데에도 중요한 역할을 하죠. 즉, 염증 발생지역의 혈관 내벽세포(endothelial cell)가 p-selectin이라는 당결합 단백질(lectin)의 일종을 막표면에 발현하게 되면, 혈액속의 면역세포가 여기에 붙어 인근 조직으로 침투하게 됩니다. 이때 selectin이 면역세포의 막 표면에 있는 당사슬에 결합하여 붙잡아주고 침투할 수 있도록 도와주는 것이죠. 그런데 아래 소개한 논문에서는 당RNA(glycoRNA)이 면역세포의 이동에 관여한다는 것을 입증하였습니다. glycoRNA가 어떻게 세포막 표면에 존재하는지는 2020년도에 처음 보고되기 시작했고 이들의 기능에 대해 사람들이 궁금해 하고 있었는데 나온 논문입니다. 아직 모든 기능이 밝혀진 것은 아니지만 염기서열과 관계된 기능을 기대했던 사람들에겐 다소 의외의 결과인 것 같습니다. 하지만 이제 glycoRNA의 존재는 확실해 졌고 이를 만드는데 관여하는 유전자들도 확인되면서 본격적인 연구가 기대되는 상황입니다. (그림 출처: Flynn et al., 2021)

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새 연구에 따르면 세포막에 결합된 RNA분자가 호중구(neutropil)의 이동에 관여함을 확인하였다.

RNA는 세포 안에 머무는 일종의 집돌이 정도로 알려져 있다. 그래서 몇몇 종류의 세포에서 세포막 표면에 RNA분자가 발견되었을 때, 연구자들은 “무슨 목적이 있는 걸까?” 하고 의문을 가졌다. 최근의 연구가 그 목적 중 하나를 밝힌 것이다: 면역세포를 염증반응 지역으로 이동시키는 것이다.

지난달 Cell지에 발표된 논문에서, Yale University의 유전학자인 Jun Lu가 이끄는 연구팀의 약물학자인 Dianqing Wu는 어떻게 세포막 표면의 RNA가 호중구(neutrophil)를 혈관 내벽세포에 붙여 조직으로 빠져나가게 하는지 설명하였다(1). 이 분자를 제거하면 면역세포가 염증반응 지역으로 빠져나가는데 실패하였고, 이는 잠재적 위협에 대해 면역시스템이 어떻게 반응하는지를 보여준 것이다.

이 연구에 직접 관여하지 않았지만 glycoRNA의 존재를 밝혔던(3) Stanford University의 생화학자인 Carolyn Bertozzi에 따르면, 오랫동안 미스터리로 남았던 세포막 RNA가 지속적으로 관심을 갖고 연구하던 이들에게 마침내 보상을 주었다고 한다. “저는 이들이 (세포막 RNA를) 호중구의 작용을 매개하는 물질로 생각했다는 게 정말 흥미로웠습니다.”

세포막 표면의 RNA는 사람의 면역세포에서 처음 탐지된 2020년에야 알려지기 시작했다(2). 그 다음해에 Bertozzi의 연구팀은 암세포와 줄기세포에서 당사슬에 결합된 형태로 표면에 산재한 RNA를 발견하였다. 당단백질(glycoprotein), 당지질(glycoliid)과 마찬가지로 당RNA(glycoRNA)라고 이름 붙여진 이 새로운 분자는 면역 수용체에 붙어있어서 면역반응에서의 역할이 예상되었다.

Lu가 처음 이 논문을 접했을 때, 그의 반응은 비판적이었다. 즉, 그는 노출된 RNA분자는 어찌 되었든 혈액내 존재하는 RNA 분해 효소(RNase)에 의해 분해될 것이라고 생각한 것이다.

“이게 과연 가능 할까? 라고 고민했죠. 당시 처음 온 박사 후 연구원에게 2달 동안 이게 사실이 아님을 밝히고 그 뒤에 다른 주제로 넘어가라고 얘기할 정도였어요.”

그의 연구팀은 biotin로 표지된 당사슬에 결합하는 분자를 이용하여 호중구의 막 표면에 있는 모든 glycoprotein과 glycolipid, 그리고 아마도 glycoRNA까지 모두 표지를 달았다. 이렇게 표지된 세포에 세포막을 파괴하지 않고 일반 체내 농도보다 훨씬 고농도의 RNase를 처리한 후, 이 세포부터 RNA를 분리하였다. 만약 이 효소처리에 의해 RNA에 따라 나오는 biotin표식이 줄어들었다면, 세포 표면의 당사슬에 RNA분자가 붙어 있다는 증거가 될 것이다. 놀랍게도 표식은 없어 졌고 이는 glycoRNA가 세포 표면에 노출되어 있다는 것을 의미한다.

만약 glycoRNA가 glycoprotein이나 glycolipid와 비슷한 역할을 한다면, 아마도 면역세포의가 염증반응부위로 이동하는 것을 도울 것이다. 이를 입증하기 위해 호중구를 붉게 염색한 후 RNase를 이용하여 그들 막표면의 glycoRNA를 제거하였다. 또 다른 그룹은 녹색으로 염색한 후 표면 RNA를 제거하지 않았다. 이렇게 염색된 두 가지 호중구를 복부 염증이 있는 생쥐에 주사하였다. 그 결과 glycoRNA가 없는 세포들은 염증 부위에 도착할 확률이 떨어지는 것을 알 수 있었다.

조직에 침투하기 위해서는 우선 바깥쪽 세포에 결합하고, 이 후 몇 겹의 세포층을 통과해야 한다. Lu는 glycoRNA가 이 두 단계에 모두 관여하는지 궁금했고, 이를 위해 호중구를 배양중인 내피세포층의 한쪽에 위치시키고 반대편에 이들의 주화성물질을 넣어 보았다. GlycoRNA가 없는 호중구는 잘 결합하지 못했고 세포층을 통한 이동도 감소하였다. 이들은 내피세포층의 장벽이 없을 때는 정상적으로 이동하는 것으로 미루어 glycoRNA가 세포의 이동성에는 영향을 주지 않는 것을 알 수 있었다.

어떻게 glycoRNA가 내벽세포에 결합하는 것을 돕는지 알아보기 위해, 연구자들은 이 분자의 당과 RNA부분을 나누어 비교해보았다. 즉, 같은 세포배양 시스템에서 glycan을 과량 처리할 경우 면역세포의 내벽세포층을 통한 이동이 억제되었다. 반면 RNA를 과량 처리했을 때는 효과가 없었다. 이 발견은 - 다른 당결합 분자들과 마찬가지로 – glycoRNA의 당사슬 부위가 단단한 결합에 관여하고 RNA는 당사슬을 막표면에 가깝게 접근시키는 효과만을 갖는 다는 것을 나타낸다.

이 경우 RNA가 단순 구조물로서의 역할을 한다면 RNA의 염기서열은 중요치 않을 것이라고 설명한다. “염기서열의 기능에 대한 숨은 비밀이 있을 수 있겠죠.” Lu는 말한다. “이건 빙산의 일각에 불과 합니다.”

연구자들은 glycoRNA의 RNA가 내부에서 왔는지 또는 다른 죽은 세포에서 방출된 외부RNA에서 왔는지 알아보고자 하였다. 이를 위해 또 붉은 색과 초록색 2 가지 염색을 통해 호중구를 각각 염색하였고, 초록색으로 염색된 호중구에서만 glycoRNA를 화학적으로 표지하였다. 이 세포들을 섞어서 사흘 동안 배양하였고, 연구진은 오직 초록 세포에서만 표식을 발견할 수 있었다. 이는 RNA가 외부에서 들여온 것이 아니라 집안에서 만들어졌다는 것을 말한다.

GlycoRNA의 RNA를 분석해보면 라이보솜 RNA, transfer RNA, small nuclear RNA 등임을 알 수 있고 이는 비암호화 RNA의 재활용일 가능성을 제시한다. 이들 RNA들이 세포막으로 가는 규칙이나 어떻게 완전히 분해되지 않고 남아 있는지 등은 아직 분명치 않다.

Yale의 연구진들에겐 앞으로 계속 추궁해야 할 질문들이 있다. 각종 질병과 관련하여 glycoRNA에 변화가 있는지 연구할 계획이다. 하지만 이들을 실시간으로 분석할 기술이 없기에 어려움이 있을 것으로 예상된다. “여러 질문을 던지기 이전에 방법론적인 개선이 필요합니다.” Wu의 말이다.


<이글은 아래의 기사를 번역한 것입니다.>

Holly Barker, PhD, 2024, Cell surface RNA helps neutropils get around. The Scientist Apr 2, 2024.

<원 기사의references>

1. Zhang N, et al. Cell surface RNAs control neutrophil recruitment. Cell. 2024;187:846-860.

2. Huang N, et al. Natural display of nuclear-encoded RNA on the cell surface and its impact on cell interactions. Genome Biol. 2020;21,225.

3. Flynn RA, et al. Small RNAs are modified with N-glycans and displayed on the surface of living cells. Cell. 2021;184, 3109-3123.e22.

biotechnology

physiology

단일가닥 DNA분자, DNA aptamer를 이용한 코카인, 헤로인, 펜타닐 분자의 검출

앱타머(Aptamer)는 특정한 분자에 결합하는 짧은 단일 가닥 DNA나 RNA 또는 유사 뉴클레오타이드 XNA를 말합니다. 길이는 20에서 100개 염기 정도로 다양하며 결합하는 물질에 따라 염기서열도 다양하죠. Aptamer를 골라내는 과정은 마치 진화과정을 연상캐 하는데요. Random한 염기서열을 갖는 DNA나 RNA 분자를 표적 분자에 결합시켜 그 중 잘 결합하는 DNA, RNA분자들만을 골라내는 것입니다. 즉, 표적 분자를 컬럼 bead나 플라스틱 표면, 또는 Nitrocellulose 필터 등에 붙인 후 여기에 random sequence를 가진 DNA나 RNA 혼합액을 흘려 그 중 표적 분자에 붙는 것만 모아 다시 PCR을 통해 증폭하고 이를 다시 컬럼에 통과시켜 더 잘 붙는 염기서열이 증폭되도록 하는 것입니다. 이 과정을 Systematic Evolution of Lignads by EXponential enrichment (SELEX)라고 하며 1990년대 처음으로 도입되어 이제 아래 글에서 소개했듯이 아주 유용한 aptamer들을 발견(?)하게 된 것이죠. Aptamer의 아이디어는 무려 1967년으로 거슬러 올라갑니다. RNA로 만들어진 효소, ribozyme이 가능한지 알아보기 위해 random sequence를 가진 다양한 RNA분자를 만들기 시작한 것이 시초라고 할 수 있습니다. 이후 aptamer가 완성되기 까지 수 많은 아이디어와 실험들이 진행된 것은 말할 필요도 없겠지요. 단백질이 아니고 DNA로 만들어졌다는 것은 안정성을 높이고 다른 분자 들과의 결합 가능성을 낮추어 특정 분자의 유무를 검출하는 도핑검사이나 진단 분야에 획기적인 발전을 줄 것으로 기대됩니다. 또한 아직 개발의 여지가 많이 남아 있는 분야라는 생각이 드는 군요.

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DNA 앱타머를 이용한 코카인, 헤로인, 그리고 펜타닐의 검출법-다른 약품과 섞여 있을 때도 가능하다.

North Carolina State University의 연구자들은 고성능 DNA aptamer를 이용한 코카인(cocain)과 다른 아편계 약물(opioid)에 대한 새로운 검출법을 개발했다. 이 검출기는 약품에 선택적이며 적은 양의 펜타닐(fentanyl), 헤로인(heroin), 그리고 코카인이 다른 약물과 섞여 있어도 감지할 수 있다. 이 검출기의 용도는 건강 관련업 종사자는 물론 법집행인 들에게도 매우 유용할 것이다.

“이 작업은 건강관련업이나 법집행부처에서 요구하는 개선된 검출법을 제공해줄 것입니다.”NC State의 화학과 부교수이며 이를 발표한 논문 2편의 공저자 이기도 한 Yi Xiao의 말이다.

“예를 들면 법집행기관에서 검출에 사용하고 있는 방법은 100년 가까이 오래된 화학반응을 통해 이루어지며 이는 선택성이 떨어져 그들이 확인하고자 하는 화합물이 아닐 수도 있다는 겁니다.” Xiao가 말을 이었다.

“그리고 현재 사용중인 코카인에 대한 aptamer는 선택적이지도 민감하지도 않아 혈액과 같은 생체조직에서 임상수준의 양을 검출할 수가 없슴니다. 하지만 우리가 개발한 검출기는 혈액내 코카인을 nanomolar 수준(이는 마이크로몰의 1/1000에 해당하는 농도이다)에서 검출할 수 있다는 거죠.”

각각 Journal of the American Chemical Society(JACS)와 JACS au에서 볼 수 있는 두 연구 결과에서, Xiao는 코카인, 헤로인, 코데인(codein), 펜타닐 그리고 다른 불법 약품들에 대한 aptamer-기반 검출기를 개발해 냈다.

앱타머(Aptamer)는 짧은 단일 가닥의 DNA 또는 RNA사슬로 특정 분자와 선택적으로 높은 친화력으로 결합한다. 즉, 다른 분자와는 결합하지 않는다는 것을 의미한다. 이 연구자들은 흥미를 갖는 물질을 임의로 만들어진 DNA 서열에 붙여보는 것으로 이 연구를 시작했다. 이렇게 어떤 aptamer가 이들 분자에 결합하는지 알아봤다.

“우리는 이 과정을 ‘bio-panning’이라고 불렀어요 왜냐하면 이건 강에서 금을 찾기 위해 강바닥 침전물을 후라이팬을 이용해 체질하는 것과 비슷했기 때문이죠.” NC Satae의 대학원생이며 논문의 공동저자인 Obtin Alkhamis의 말이다. “일단 결합한 것과 결합하지 않은 것을 분리하면, 선택적으로 원하는 분자에만 결합하는지 확인하기 위해 그 aptamer를 다른 방해가 되는 분자들과 결합하는지 아주 심할 정도로 조사한 겁니다.”

그리고 이렇게 선택된 aptamer를 약물 복합체, 알약 그리고 혈액 등에 결합하는지 검사했다. 혹시 다른 약물이나 단백질등에 결합하는지 확인해본 것이다.

Xiao의 연구진은 혈청내 10 nanomolar (약 30 nanogram/mL의 농도) 수준의 cocaine을 검출하는데 성공하였다. 이는 예전에 50% 혈청액 속에 최저 10 micromolar 농도의 코카인을 검출할 수 있었던 과거의 aptamer보다 1000배 정도 민감한 것이다.

이에 더해 University of California Santa Barbara의 협력팀은 이 aptamer를 전극에 삽입할 수 있었고 이를 이용해 쥐의 혈액내 (정맥) 약물 농도를 10초 간격으로 실시간으로 측정할 수 있었다. 이는 남용 약물의 약물학적 측정이 가능하게 된 최초의 연구라고 할 수 있다.

아편-특이적 aptamer는 발색반응에 활용되어 용액내 헤로인, 옥시코돈(oxycodone) 등을 0.5 micromolar농도까지 측정할 수 있었다. 발색반응 정량은 표적 물질에 결합하면 색이 바뀌는 것이다. 이 정량법은 아편계물질이 복잡한 화학매질(알약이나 의약품 복합물 등)에 있어도 수 초안에 검출할 수 있다.

비교하자면, 법조계에서 사용하는 “Marquis test”는 다른 화합과 섞여 있는 경우 아편을 검출할 수 없다.

이 연구자들은 이 aptamer가 건강분야나 법조계에 유용하게 활용될 것이라고 믿는다.

“이 aptamer들은 대량 생산이 가능합니다. 또한 보관 기간도 길고, 화학적 변형도 용이하여 개발중인 검출기에 쉽게 적용시킬 수 있습니다.” Xiao의 말이다. “이 물질들은 시험용지에 묻힐 수도 있어 현장에서 일하는 경찰들이나 가정에서나 또는 의사들이 환자에 대해서도 사용이 가능하게 만들 수 있죠.”

“임상 수준에서의 검출이 가능하기 때문에 응급실에서 환자가 어떤 약물을 복용 또는 투약했는지 피 한 방ㅇ우로 알 수 있습니다. 예전에는 혈액을 채취하고 실험실에 보내야 가능했던 일이죠.” Alkhamis의 말이다. “사용 가능성에 정말 흥분됩니다.”


<이글은 아래의 기사를 번역한 것입니다.>

DNA aptamer drug sensors can instantly detect cocaine, heroin and fentanyl—even when combined with other drugs (2024, March 4) retrieved 8 March 2024 from https://medicalxpress.com/news/2024-03-dna-aptamer-drug-sensors-instantly.html

<원 기사의 refences>

More information: Obtin Alkhamis et al, High-Affinity Aptamers for In Vitro and In Vivo Cocaine Sensing, Journal of the American Chemical Society (2024). DOI: 10.1021/jacs.3c11350

Juan Canoura et al, Developing Aptamer-Based Colorimetric Opioid Tests, JACS Au (2024). DOI: 10.1021/jacsau.3c00801

biotechnology

genetics

새로운 AI가 단일세포의 유전자발현을 예측한다.

인공지능의 개발로 모든 분야에 큰 변화가 예상됩니다. 특히 앞으로 사회로 진출하기 위해 많은 것을 준비해야할 젊은 세대들에겐 인공지능에 영향을 받지 않을 직업이 무엇인지가 초미의 관심사 라고 합니다. 하지만 사실 어떤 전문가도 앞으로 AI가 어떤 방향으로 발전할지 예측하기는 어려울 것 같습니다. 저도 과학자로서 생물학에서 활용할 수 있는 AI에 대해 많은 관심과 공부를 하고 있지만 아직 모르는 것이 너무 많거나 아니면 AI분야의 발전 속도가 너무 빠른 것 같습니다. 다만 한 가지 분명한 것은 지금 인류는 마치 인간이 원자폭탄을 처음 만들어낸 후 원자폭탄이 없던 시절로 돌아가지는 못하는 것처럼 AI가 없는 시절로 돌아가는 것은 불가능하다는 점입니다. 다양한 AI의 능력을 이용하는 것이 앞으로 우리 인류가 발전하는데 중요한 역할을 할 것이고, 그 동안 풀지 못했던 난제들을 풀 수 있는 가능성이 열린 셈입니다. 그런데 만약 영화 로보캅이나 터미네이터에서 본 것처럼 AI를 탑재한 경찰이나 비밀요원 로봇이 거리를 돌아다니며 사람들을 체포, 살상한다면 어떨까요? 더나가서는 AI가 경쟁하여 또 다른 종류의 생물로 진화한다면 인류문명 전체를 위협할 수도 있을 것입니다. 전혀 불가능한 일은 아니기에 국제적인 규약과 실천을 통해 사전에 예방하는 것이 지금 필요하다고 과학자들은 주장하고 있습니다. 여기 소개한 AI는 세포를 특정한 유전자들을 발현하는 시스템으로 이해하고, 이들이 유전자 발현에 변화를 주었을 때 어떻게 반응하는지 자료를 분석하여, 그 세포의 종류(유전자 발현 패턴)을 파악하고 특정한 유전자를 없엤을 때 세포의 행동(유전자 발현)이 어떻게 변할지를 예측하고자 시도한 것입니다. 관심있는 분은 원 논문의 link(https://github.com/bowang-lab/scGPT)를 따라가면 사용해 볼 수 있습니다.

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인공지능 도구(artificial intelligence tool)scGPT가 세포의 종류를 알아내고, 유전자들의 결손 시 나타날 결과를 예측하며 특정 유전자들 간에 상호작용을 잡아낼 수 있다.

과학자들은 질병을 연구하기 위해 전체 세포집단의 유전자 발현을 연구한다. 예를 들면, 암과 관련된 약 개발을 위한 단백질 표적을 찾고 알츠하이머병의 초기 진단을 위한 혈액내 바이오 마커를 찾기 위해 RNA 염기서열분석(시퀀싱, sequencing)을 실시한다.

최근에 과학자들은 단일 세포 RNA 시퀀싱(single cell RNA sequencing, scRNA-seq)을 통해 단일 세포들 간에 유전자 발현에 어떤 차이가 나는지도 알 수 있다. 과학자들은 특히 scRNA-seq의 데이타를 머신 러닝 프로그램을 이용해 시작부터 특정한 일들을 수행하는 데까지 활용하고 있다.

Bo Wang은 University of Toronto의 생물학자이자 컴퓨터 생물학자로 single cell generative pretrained transformer(scGPT)라고 부르는새로운 AI 도구를 만들었다. 이 모델은 scRNA-seq의 데이타를 미세하게 조정하여 다양한 일들을 수행할 수 있다. 여기에는 특정한 유전자를 조작했을 때 나타날 영향을 예측하거나 데이터들을 합해서 알기 어려운 세포의 종류를 감정해내는 것 등이 포함된다.

scGPT는 기초가 되는 AI 도구이다. 이 핵심 모델을 이용하여 새로 구축하고 변형하여 하위 작업들을 수행할 수 있기 때문이다. 날로 인기 상승중인 대화형 AI, ChatGPT와 같은 방식으로 작동한다. ChatGPT는 답을 문장으로 내놓는 반면 scGPT는 세포수준에서의 유전자 발현을 예측한다.

Wang에 따르면 하나의 기초 모델을 플렛폼으로 사용하는 것은 서로 다른 분석 결과를 비교할 때 여러 모델을 이용한 것에 비해 잘못될위험이 적기 때문에 유리하다고 한다. 각 컴퓨터 분석에서는 같은 데이터라도 생성된 구조에 따라 다른 가설을 만들기 때문에 정확치못한 결론에 다다를 수 있다.

최근의 출판전 논문에서, Wang의 연구진은 기존의 방법들에 비해 scGPT가 scRNA-seq을 잘 분석 한다는 것을 보여주었다. 그들은 최초 4일간 혈액과 골수 세포에서 얻은 일천삼십만개의 scRNA-seq 데이터를 입력하여 scGPT를 학습 시켰다. 여기에는 50개 이상의 세포 종류가 포함되어 있다. 이는 AI가 세포 안에서 또는 세포 간에 유전자 발현이 어떻게 근본적으로 연결되었는 지를 배울 수 있게 했다.

주어진 세포에서 모든 유전자가 발현되고 있는 것은 아니기 때문에 각 세포는 20,000개 유전자 중 수 천개에 대한 정보를 제공한다. 이들을 종합한 결과 유전체 내의 거의 모든 유전자에 대한 정보를 갖게 되었다. 이 연구진은 예전에 얻은 사람의 면역세포에서 얻은 10가지 서로 다른 scRNA-seq 데이터 덩어리를 통합해서 기초 모델을 세밀하게 조정할 수 있었다. 각 데이터의 일부를 이용하여 학습시켜 서로 다른 데이터에서 보다 일반화된 집단으로 같은 세포를 분류할 수 있도록 하였다. scGPT는 각 데이터군 간에 비생물학적인 요인에 의한 차이도 적용하도록 배웠다. 예를 들면 시행된 날자, 세포를 수획한 방법 등이다. 데이터군 통합(batch integration)으로 알려진 이 방식으로 데이터 베이스를 모아 거의 모든 세포 종류에 대해 다량의 데이터를 모을 수 있고, 이를 이용해 건강하거나 아플 때 관여하는 희귀한 세포들을 감지하고 밝힐 수 있게 해줄 것이다. 


연구자들은 이렇게 미세조정된 scGPT와 가장 많이 사용되는 3 가지 방법이 합쳐져 감춰두었던 데이터를 얼마나 잘 다루는지 알아보았다. scGPT는 각기 다른 데이터 집단에서 표준 모델보다 약 5% 더 효율적으로 세포종류를 분류하였고 많이 이용되는 방법과 유사한 정도로 비생물학적인 영향을 고쳐낼 수 있었다.

연구진은 또 다른 잘 다듬어진 scGPT, GEARS라고 부르는 표준 모델과 비교하여 80여개 유전자를 변동시켰을 때 단독 또는 쌍으로다른 유전자에 미치는 영향을 얼마나 잘 예측하는지 비교하였다. 각 유전자 조작에 따라 가장 영향을 많이 받는 20개 유전자들에 집중하였고, Wang과 동료들은 scGPT가 가장 앞선다는 것을 발견하였다.

“이런 진전이 정말 생물학적 지식을 더해주는 걸까요? 새로운 가설을 세우는데 유용할까요?” 이 연구에 직접 관여하지 않았던 네덜란드의 Leiden University Medical Center의 컴퓨터 생물학자인 Ahmed Mahfouz의 질문이다.

이런 발견은 분명해 보이지만 Mahfouz는 여기에는 수백만가지의 변수가 있고 훈련에는 엄청나게 많은 데이터가 필요하다고 조심스럽게 언급했다. 결과적으로 이들은 엄청난 양의 에너지를 소모해야하고 엄청난 양의 탄소 산물이 남기게 될 것이다. 이런 고에너지 요구량과 연구자들이 세밀한 조정을 위해 머신러닝과 친숙 해져야 한다는 점을 고려할 때, 세포생물학자 들에게 scGPT가 얼마나 사용될지는 의문이다.

그럼에도 불구하고 “미세조정은 아주 효울적입니다.” Wang의 말이다. “예를 들어 10,000 에서 20,000개의 세포에 대한 데이터를 처리하는 데는 약 5 내지 10분 정도 걸립니다.” 이들은 scGPT를 사용자들이 보다 쉽게 접근할 수 있게 만들기를 원한다. “우리는 모든 사람이 이용할 수 있는 code와 모델을 만들었고 교육용 web site를 만들기 위해 정말 열심히 일하고 있습니다. 이를 통해 수많은 사용법 교육과 이를 이용해 풀 수 있는 작업들에 대한 실질적인 예를 제공할 것입니다.”라고 말했다.

Wang의 연구팀은 계속 scGPT에 대한 작업을 계속할 예정이다. 이 모델의 첫 시도는 골수와 면역세포를 분석하는데 유용한 반면, 이팀이 최근에 발표한 scGPT 업그레이드 모델은 3천3백만 세포의 세포를 이용해 훈련이 이루어졌다. 여기에는 뇌, 혈액, 췌장, 폐, 심장,신장, 암 그리고 장의 세포들이 포함된다.

최근에는 scGPT와 비슷한 기초가 될 모델들이 발표되었고 어떤 것이 연구에 많이 활용될지 곧 알게 될 것이다. Mahfouz는 멀지 않은미래에 scGPT와 같은 모델들이 생물학의 중요한 질문들에 답을 줄 것이라고 예측하며, 이는 오직 시간이 입증해 줄 것이다. “지금은 흥미로운 시기입니다. 올해가 끝날 때쯤이면 지금과는 사뭇 다른 그림을 보게 될 것입니다.”


<이글은 아래의 기사를 번역한 것입니다.>

Carissa Wong, PhD., A new AI tool predicts gene expression in a single cell. The Scientist Aug 21, 2023.

biotechnology

genetics

유전자 편집: prime editing의 시대가 온다.

유전자 편집기술의 발달이 날로 급속히 빨라지고 있습니다. 여기 소개한 prime editing은 이미 임상에 사용되기 시작했고 (참고: 최초로 인간에게 시도된 염기편집 치료법, 2023-12-29) 다른 기술들도 여러 유전 질환에 금방이라도 투입될 태세입니다. 이런 새로운 의료기술의 발달과 치료법의 성공은 가히 놀라운 일이고 과학기술의 업적이라고 부를만 하죠. 그런데 새로운 의료기술이 사회에 적용될 때 항상 뒤따르는 것이 안전문제입니다. 새로운 의료기술의 도입은 언제나 희생이 따르기 마련인것 같습니다. 한예로 처음 신장이식 수술을 시도했던 의사들은 이식의 실패가 수술법의 미완성에 있다고 생각하고 수술시간 단축이나 혈관봉합술 등에 집중했지만 정작 주된 원인인 면역거부반응을 몰랐던 것입니다. 결국 수 많은 희생자가 발생한 뒤에, 면역반응을 제어하는 기술이 발달하고 나서야 신장이식 성공율이 높아진 것을 볼 수 있었습니다. 이렇게 까지했어야 하나? 라는 비판과 검찰의 기소까지 이루어졌지만 결국 의사들은 무죄로 석방되었죠. 그럼에도 불구하고 이런 시도가 현재 수많은 사람들의 목숨을 살리는 장기이식의 기초가 된 것이 사실입니다. 새로운 의료기술의 도입을 언제까지 미룰 것인가를 판단하기는 어렵습니다. 다만 강조하고 싶은 것은 mRNA백신에서 보았듯이 어려운 환경에서도 새로운 기술의 완성을 위해 노력한 과학자와 협력자들이 있기에 코로나19라는 전 지구적 위기 상황에서 인류를 구원할 수 있었다는 점입니다. 이런 의료기술이 활용되지 못했다면 얼마나 더 많은 희생을 낳았을 지는 상상하기도 어렵습니다. ​앞으로 유전자편집 기술이 새로운 치료법으로 대두될 가능성이 높습니다. 얼마나 희생을 줄이고 목표를 달성할 수 있을지는 두고볼 일이죠. 다만 돈과 명예를 위해 충분한 검증도 없이 위험한 시도를 서슴치 않는 일은 없어야 할 것입니다.

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Prime Editing 기술은 2019년에 발표된 이후 빛의 속도로 발전하고 있다. 과연 어떤 일들을 해 낼 수 있을까?

CRISPR는 아마도 현존하는 가장 인기있는 유전자 편집 기술일 것이다. 하지만 분명해보이는CRISPR의 성공에도 불구하고 이 과정에서 생기는 DNA의double-stranded break가 원치 않는 위험한 편집으로 이어지지 않을까 걱정되는 부분이 있다. 이와 함께 방법에 따라서는 염기편집에 필요한 단일 염기의치환에 비해 큰 변화를 필요로 하는 경우가 있다. 프라임 에디팅(Prime Editing)은 DNA분자의 두 가닥 모두를 자르지 않고도 단일 염기 수준의 정확도로표적을 편집할 수 있어 새로운 해결책이 될 수 있다.

이 기술의 고안자인 Andrew Anzalone과 David Liu가 2019년에 처음 발표한 이후, 이들은 다음 세대의 기술로 발전시켰고 회사를 만들어 처음으로 임상전 결과들을 내기 시작했다. 이제 prime editing은 마지막 목표, 즉 치료의 길로 향해 가는 셈이다.


Prime Editing은 어떻게 작동할까?

Prime editingprime editing guide RNA(pegRNA)Cas9 효소와 역전사효소(reverse transcriptase)를 결합시킨 단백질로 구성되어 있다. Prime editing에 사용된 CAS9은 원래 가지고 있던 두개의 nuclease(DNA분해효소) 부위 중 하나를 불활성화 시켜 ‘nickase’, 즉 한 가닥 만을 잘라 nick(잘린 부위를 말함)을 만든다. 따라서 pegRNA가 한쪽 DNA에 결합하면 CAS9에 의해 잘린 가닥의 일부가 밖으로 삐져나온다(flap).

pegRNA의 다른 한쪽 끝은 주형의 역할을 한다: 일부는 삐져나온 부분과 상보적이고 나머지 부위는 편집된 염기서열을 지니고 있다. 삐져나온 부위와pegRNA일부가 결합한 후 역전사효소에 의해 pegRNA를 주형으로 원하는 DNA염기서열이 만들어진다. 이렇게 만들어진 조각은 다시 원래의 DNA분자에 끼어들어간다. 상보적인 가닥의 2번째 nick의 도움으로 원래의 가닥은 제거되고, DNA 손상회복 기전에 의해 다른 가닥도 원하는 염기서열로 바뀌게 된다.

Broad Institute에서 Liu의 실험실에서 일하는 동안, Anzalone은 실험관에서의 유전자 편집에는 성공했다. 하지만 인간 세포에서의 첫 실험은 실패했다. 그는 아마도 flap(삐져나온 부위)와 결합하는 pegRNA의 길이에 문제가 있었다고 생각했다. 다음 실험에서 그는 시험관에서 사용한 것에 비해 단 한 개의 염기를 더 붙여 실험하게 되었다. “그 단 하나가 백그라운드 편집 확률보다 높게 나오게 한 것 같았죠.”라고 말했다. 마침내 2019년에 그는 유전자 편집에 있어 믿을 만한 기술을 확보하게 되었다. 그는 좀더 긴 결합서열을 이용해 실험을 반복했고, “그때 저는 실험실에 있었어요 – 아마 수요일이었던 것 같습니다. – 내가 있던 Broad Institute에는 몇 명의 사람들이 더 있었습니다. 그들은 내 어깨 너머로 데이터를 분석하는 과정과 마침내 유전자 편집 성공률(%)이 한자릿 수를 보이기 시작한 걸 보았죠. 아주 흥분된 하루였습니다.”라고 말했다. Nature에 게재된 이 논문을 심사했던 University of California, Berkeley의 생물공학자인 Fyodor Urnov는 “제가 무엇보다 놀란 것은 이것이 대표하는 주제의 놀라운 확장성입니다.”라고 말했다. 이어 “우리가 자연으로부터 무언가를 원한다면 자연과 싸울게 아니라, 협동해야 하는 겁니다.”라고 말했다.


Twin prime: 차세대의 prime editor

최초의 prime editing은 단일 염기 치환에서 십여 개 염기의 삽입이나 제거에 이르는 비교적 작은 돌연변이에 집중되었고, 질병과 관련된 긴 서열을 고치기는 불가능했다. 결국 Anzalone, Liu 그리고 동료들은 twin prime editing을 들고나오게 된다. Twin prime editing이란 이름은 수학의 twin prime conjecture에서 따온 이름으로 소수(prime number)가 무한한 것처럼 소수의 쌍, 즉 17과 19처럼 p, p+2의 관계를 갖는 수도 무한하다는 추측이다. Anzalone의 동료중 수학을 전공하는 친구가 있었고, “재미있는 생각인 것 같아요.”라고 말했다.

Twin prime editing을 위해서 AnzaloneLiu2개의 pegRNA를 이용했다. 가운데가 겹치는 2개의 삐져나오는 부위(flap)를 만들어 각각 다른 pegRNA에의해 반반씩 만들어지도록 하여 보다 큰 DNA부위를 편집하는 것이다. 하지만 이 twin prime editing 방법을 써도 100 bp이상의 긴 DNA 조각을 넣는 것은 어렵다. 이를 해결하기 위해 이들은 중간에 또 다른 부위를 삽입했다:특정부위 재조합효소(site-specific recombinase)이다. 자연계에서 이 효소는 DNA의 특정 부위를 인식하여 자르고 큰 조각을 붙인 뒤 다시 연결한다.Anzalone과 Liu의 연구팀에겐 이런 능력을 가진 효소를 twin prime editing의 삽입 능력을 향상시키는데 사용하는 것이 완벽해 보였다.

이들은 이 효소의 자리 인식에 twin prime editing을 사용하기로 하였다. Anzalone과 Liu가 함께 설립하고 현재 Anzalone이 일하고 있는 Prime Medicine사는 이 prime assisted site specific integrase gene editing을 bulked-up twin prime editing system PASSIGE라고 이름 붙였다. “이것으로 유전자 크기의 조합이 가능해졌습니다.” Anzalone의 말이다.

Anzalone과 Liu는 PASSIGE를 이용해서 작거나, 중간 또는 큰 수준의 편집이 가능한 prime editing의 도구를 만들어낸 것이다. 다음 단계는 분명해 보인다. 어떻게 이를 이용해 새로운 유전자 치료법을 개발해 내는가 하는 것이다.


Prime editing의 전망

여러 prime editing system이 있지만 치료를 위한 prime editing의 개발은 다른 유전체 편집에 비해 어려울 수 있다. “이는 원조 CRISPR-Cas9 system이나RNA를 사용한 표적부위의 염기 편집처럼 간단하지는 않습니다.” Anzalone의 말이다. “Prime editing에서 guide sequence에 대한 다양한 조작과 변형을주어 편집 효율에 있어 정말 큰 차이를 만들어냈습니다.”

편집 효율을 높이는 것에 어려움이 있긴 하지만 이걸 이유로 몇몇 질환들에 대한 Prime Medicine을 멈추게 할 수는 없었다. 그들은 ex vivo 프로그램에서만성 육아종병(chronic granulomatous diseases, CGD; 식세포의 기능이 떨어져 지속적인 감염증이 나타나는 면역결핍질환으로 유전병으로 알려져 있다.)을 치료하는데 가장 앞서 나가고 있다. “우리는 굉장히 믿을 만한 전임상 결과들을 갖고 있습니다.” Anzalone이 말했다.

Anzalone은 아직 시작에 불과하다고 생각한다. “점돌연변이를 교정하는 것을 넘어서, 반복부위 확장(repeated region expansion)으로 인한 질병, 예를 들면 허딩턴병(Huntington’s disease)이나 프리드리히형 실조증(Friedreich’s ataxia)에 대해 질병유발 반복부위를 제거하여 환자들에게 유효한 영향을 줄 수있다고 생각합니다.” 그는 또한 암을 제거하는 CAR-T 세포를 만들 수도 있다고 한다. “아직 우리의 진행 계획에 올라와 있지도 않지만 말이죠.”

Urnov는 이 과정이 매우 흥미롭고 Prime Medicine을 환자에게 빨리 적용해보는 것이 급선무라고 한다. “prime editing이 해야할 일은 그들이 제시한 계획에 따라 이 기술을 이용하여 본보기로 한 두가지 질환에 대한 발전을 강행해야 할 필요가 있습니다.”라고 말했다.

그는 Anzalone과 그의 연구팀이 환자를 도울 어떤 변환작업을 하는 대신 기술적 완성에 집중하는 것을 보고 싶지는 않다고 했다. “임상에 적용할 때까지기술의 잠재력과 안전을 위해 최적화 할 수 있다는 생각은 이 분야에서는 옳은 태도가 아닙니다.”라고 말한다. 그의 의견에 따르면 만약 제한 기준에 맞고환자들에 관해서도 투명하다면 그것으로 충분하다는 것이다. “prime editing의 적용을 기다릴 이유는 없다고 생각해요.”

Anzalone은 Prime Medicine이 두 가지 목표를 모두 이루기를 바라고 있다. 그는 prime editing의 혜택을 최대한으로 끌어올리는 방법으로 소위 “marchingup the chromosome (염색체 행진)”이라고 부르는 방법을 생각한다. 즉, 가장 보편적인 환자 집단에 하나의 돌연변이를 넣고 결과에 따라 각기 다른pegRNA를 이용해 2번, 3번 시도를 계속하는 것이다. 다른 하나는 “long flap” system을 이용해 환자집단에서 볼 수 있는 특정한 엑손의 모든 돌연변이를한번에 대치하는 것이다. “하나의 치료제가 한 환자가 아니라 많은 수의 환자를 치료하는 거죠.”라고 말한다.

이런 희망사항들이 결실을 맺기 까지는 많은 시간이 필요할 것이다. 그 동안 그는 그들이 개발한 기술을 더욱 발전시킬 것이다. 하지만 이런 과정에서 새로운 기술이 선호되고 전략화되기가 얼마나 어려운지 보여주기도 한다. 어느 질병을 택할 것인가? 누가 최초로 시도할 것인가? 이런 질문들은 쉽게 답할수 없는 것들이다.

“새로운 생명과학기술의 경우는 (목표에 도달하기 위해서) 얼마나 많은 것들을 해야하는지 파악하는 것입니다.” Anzalone은 말한다. “이곳의 모든 사람들은 (이 모든 것들이) 어떻게 될지 보고 싶죠. 만약 우리가 그런 위치에 갈 수 없다면 창피한 일이 될 겁니다.”라며 말을 맺었다.


<이글은 아래의 기사를 번역한 것입니다.>

Ida Emilie Steinmark, PhD., Prime editing comes of age. The Scientist Sep 8, 2023

<References>

1. Kosicki M, et al. Repair of double-strand breaks induced by CRISPR-Cas9 leads to large deletions and complex rearrangements. Nat Biotechnol.2018;36(8):765-771.

2. Anzalone AV, et al. Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA. Nature. 2019;576(7785):149-157.

3. Anzalone AV, et al. Programmable deletion, replacement, integration and inversion of large DNA sequences with twin prime editing. Nat Biotechnol.2022;40(5):731-740.

4. Zhao Z, et al. Prime editing: advances and therapeutic applications. Trends Biotechnol. 2023.

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